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凝血实验规范化问题的探讨

   凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(Fbg)和凝血酶时间(TT)是凝血机能障碍和抗凝治疗检测时的常规过筛性试验。从这些检测方法建立并应用于临床以来,临床和实验室的专家们就一直致力于实现测定方法和报告方式的规范化,迄今为止,只在PT应用上取得了一定程度的进展,也就是INR系统的建立;而APTT的标准化仍然停留在探索阶段。由于凝血实验(特别是自动化凝血检验)起步较晚,反应复杂,试剂存在较大差异性,造成了临床应用中缺乏标准化规范而出现了一些问题。本文就凝血实验中一些重要概念的定义以及适用性加以讨论,以便在临床工作中理解和运用。  

       一、凝血参数检验的准确性  

       与其他临床化学检验的方法学评估一样,我们需要了解凝血实验测定的准确度。就某种物质的浓度或活性而言,一旦检测方法确立,已知靶值时可以测定其准确度。在凝血检验中,由于凝集反应(如PT)包含了诸多凝血因子的参与,其测定结果反映的并不是单一物质的缺乏或增多,虽然其结果是定量指标,但是这一指标更多地反映了一系列凝集蛋白的相对活性。由于目前临床应用的PT和APTT测定试剂具有多样性,而且凝血因子对于不同的试剂敏感性并不相同,因此即便是以手工方法用不同试剂测定同一份血浆标本时,结果也不具有一致性。  

       凝血分析仪的出现不仅为批量处理标本和简化操作提供了可能,也给检测的规范化带来更大的困难,甚至可以说更加难以标准化。处于各方面因素的考虑,每个仪器制造商几乎都使用不同的配套试剂。除了试剂不一致外,检测原理也不尽相同,判定终点也不相同,由此得到"定量"结果—凝集时间也不相同。在这种情况下,没有绝对的准确而言。  

       即便是已经得到广泛研究和认可的国际标准化比值(INR),也有多中心临床试验表明实验室间存在着显著差异。在使用同种试剂的情况下,不同仪器测定结果之间的差异是显著的。原因之一就是在使用仪器的情况下凝血活酶的ISI定值不仅单纯由试剂决定,还取决于凝血仪的类型,有些研究在默认ISI适用于不同仪器的前提下研究仪器之间的可比性,造成了业内对试剂校准和系统校准的混淆。  

       二、质控血浆的赋值  

       在关于准确度的临床评估中,由于没有标准品可用,既往方案多使用质控血浆当作定值标准品,这种所谓的替代方法存在着严重错误,长期以来为人诟病。首先质控血浆不是标准品,用于质量控制过程的物质的最低要求包括两点:(1)具有均一性,将质控物的批内差减到最小,才能更好地保证表现出来检测体系的波动;(2)具有适当的稳定性,在有效期内质控物的性能或浓度基本不变是质量控制的前提。在此基础上,可以提供质控物某一指标的测定范围,也可以不予赋值。我们在临床使用的质控血浆绝大多数是赋值的,即标识了某个测定范围,因此有人就把质控血浆的测定结果是否在此范围内作为考察准确度的依据。应该注意的是,凝血实验中除了Fbg定量以外的其他三个实验,都是"系统依赖性"测定,即检验结果受到试剂的类型、批号、仪器及其状态等多重因素的影响,任一因素发生变化都将使结果发生改变。比如,检测系统类型、接触活化因子以及试剂磷脂成份都会导致APTT反应的差异性,直接产生结果波动。日常质控使用质控血浆时,试剂已经与厂家测定时不是一个批次了,这时血浆的赋值已不再适用。此外,如果质控血浆赋值使用的机型和试剂种类、批号等都不明确,就使赋值区间更是形同虚设了。  

       其次,质控血浆经制造商测定后根据统计学原理提供的检测范围,至少包括了原检测体系下全部测定值的4SD,如果说在这个区间内都视为准确显然不妥。对于这个赋值范围的理解,笔者认为是供用户在使用相同或相似检测体系时选择质控目标区间的一种参考,没有任何靶值的提示或意义。  
  三、关于参数的定量及其参考范围  

       如前所述,常规凝血检验的四个项目中只有Fbg是可以定量的(Clauss法),Clauss法使用的标准曲线可以溯源到国际标准品,可以实现标准化, 而衍生法Fbg定量是根据血浆浊度变化来换算结果,不仅与真实浓度存在偏差而且也不能标准化。国内销售的Fbg定标血浆多数经过WHO参考血浆(如#98/612)校准定值,但是用户在使用时通常不注意试剂批号的变化,造成了实验室之间测定结果的差异。由于实验室很难直接使用国际标准品或参比血浆来校准自己的工作曲线,批号造成的Fbg定量差异不易消除;同时由于Fbg测定试剂是单一凝血酶,每次又是过量使用,所以这种差异还不是很大。PT和APTT的情况则迥然不同,在试剂成份上二者都使用了不同类型的混合物,其中的不同成份对凝血因子的敏感性不同,从而导致使用不同品牌或批号的试剂时,结果出现较大差异,如果与不同原理的凝血仪搭配组合,其波动幅度甚为可观。笔者认为,试剂的特殊性、检测方法和终点判定的差异性从根本上决定了这些指标应用的特异性,也即不同检测体系具有各自独立的参考范围。尽管这些指标是定量的,其量值却不具有溯源性,而且其参考范围具有及时更新的必要性,当仪器维护或校准、试剂批号更换之后,有必要重新确定内部参考范围,这与血细胞计数的要求是完全不同的。 

       如此做法对于临床实验室无论在成本消耗上,还是志愿者选择上都有一定难度,而且频繁变化的参考范围不利于报告解释。在实践中我们不妨沿用正常对照的方法,比如,超出正常对照3秒以上视为PT异常,该对照可以是新鲜血,也可以是冷冻健康人血浆,在一定时限内可以作为正常对照使用。  

       INR作为PT标准化的一种尝试日趋完善,在抗凝治疗中其参考范围已经得到了成熟应用,因此INR这一演算比值及其治疗的预期范围是应该继续沿用的。应该注意的是,基于手工方法的INR报告方式推行以后,自动化凝血仪逐步得到了广泛使用。仪器测试原理与手工法显著不同,对凝血活酶ISI以至INR产生较大的影响而且程度不确定,仪器的广泛使用破坏了INR体系原有的可靠性和精密度。据文献报道,同一厂家的相同机型对INR的影响都显著不同,因此对仪器的校正就显得十分必要。  

       我们必须明确:INR是WHO利用IRP标定凝血活酶试剂后,手工测定PT时优化报告的一种方法和理念。在此基础上可以减少室间差异及提高报告的可比性,凝血活酶校准时要求使用参考品和试管倾斜方法判定结果,然而,将商品化凝血活酶在自动化凝血仪上检测标本时,原理发生了改变,这种校准方法的基础已经不复存在了。这时我们校准的不再仅仅是凝血活酶,而是检测系统—包括凝血活酶和检测技术(仪器)的系统。此外,还要严格限定试剂标识ISI的适用范围。早期试剂的ISI都是针对手工法确定的,为了避免混乱,通过多年研究和专家的倡导,厂家已经开始分别提供针对不同仪器型号的凝血活酶ISI,但是要测定不同仪器和试剂所有组合的各自ISI显然是不可能的;有研究表明,制造商为每一批凝血活酶试剂提供的ISI不一定就是准确的,定标血浆的不当使用将导致INR的校准偏差;这使实验室内部校准显得尤为必要。  

       国外自动化凝血分析仪发展的四十余年是个技术推陈出新、概念提出并不断完善的过程,我国在短时间内完成了设备的升级换代,而在基本概念和应用中还有一些模糊甚至错误的认识和做法。总而言之,虽然凝血检验的结果都是定量指标,但是准确度的概念由于试剂和方法等方面的因素至少在目前还不适于PT、APTT和TT的评价,同时这三个指标也不适于建立或提出通行的参考范围,必要时可参照正常对照标本的测定值进行结果解释。INR的参考范围仅适用于抗凝治疗,而不能在凝血功能筛查时使用。质控血浆作为评估系统稳定性的均一物质,其赋值区间不一定适用于实验室检测体系,不能作为参考物质或标准品使用。  

   

       文章来源:网络转载

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    凝血实验规范化问题的探讨

       凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(Fbg)和凝血酶时间(TT)是凝血机能障碍和抗凝治疗检测时的常规过筛性试验。从这些检测方法建立并应用于临床以来,临床和实验室的专家们就一直致力于实现测定方法和报告方式的规范化,迄今为止,只在PT应用上取得了一定程度的进展,也就是INR系统的建立;而APTT的标准化仍然停留在探索阶段。由于凝血实验(特别是自动化凝血检验)起步较晚,反应复杂,试剂存在较大差异性,造成了临床应用中缺乏标准化规范而出现了一些问题。本文就凝血实验中一些重要概念的定义以及适用性加以讨论,以便在临床工作中理解和运用。  

           一、凝血参数检验的准确性  

           与其他临床化学检验的方法学评估一样,我们需要了解凝血实验测定的准确度。就某种物质的浓度或活性而言,一旦检测方法确立,已知靶值时可以测定其准确度。在凝血检验中,由于凝集反应(如PT)包含了诸多凝血因子的参与,其测定结果反映的并不是单一物质的缺乏或增多,虽然其结果是定量指标,但是这一指标更多地反映了一系列凝集蛋白的相对活性。由于目前临床应用的PT和APTT测定试剂具有多样性,而且凝血因子对于不同的试剂敏感性并不相同,因此即便是以手工方法用不同试剂测定同一份血浆标本时,结果也不具有一致性。  

           凝血分析仪的出现不仅为批量处理标本和简化操作提供了可能,也给检测的规范化带来更大的困难,甚至可以说更加难以标准化。处于各方面因素的考虑,每个仪器制造商几乎都使用不同的配套试剂。除了试剂不一致外,检测原理也不尽相同,判定终点也不相同,由此得到"定量"结果—凝集时间也不相同。在这种情况下,没有绝对的准确而言。  

           即便是已经得到广泛研究和认可的国际标准化比值(INR),也有多中心临床试验表明实验室间存在着显著差异。在使用同种试剂的情况下,不同仪器测定结果之间的差异是显著的。原因之一就是在使用仪器的情况下凝血活酶的ISI定值不仅单纯由试剂决定,还取决于凝血仪的类型,有些研究在默认ISI适用于不同仪器的前提下研究仪器之间的可比性,造成了业内对试剂校准和系统校准的混淆。  

           二、质控血浆的赋值  

           在关于准确度的临床评估中,由于没有标准品可用,既往方案多使用质控血浆当作定值标准品,这种所谓的替代方法存在着严重错误,长期以来为人诟病。首先质控血浆不是标准品,用于质量控制过程的物质的最低要求包括两点:(1)具有均一性,将质控物的批内差减到最小,才能更好地保证表现出来检测体系的波动;(2)具有适当的稳定性,在有效期内质控物的性能或浓度基本不变是质量控制的前提。在此基础上,可以提供质控物某一指标的测定范围,也可以不予赋值。我们在临床使用的质控血浆绝大多数是赋值的,即标识了某个测定范围,因此有人就把质控血浆的测定结果是否在此范围内作为考察准确度的依据。应该注意的是,凝血实验中除了Fbg定量以外的其他三个实验,都是"系统依赖性"测定,即检验结果受到试剂的类型、批号、仪器及其状态等多重因素的影响,任一因素发生变化都将使结果发生改变。比如,检测系统类型、接触活化因子以及试剂磷脂成份都会导致APTT反应的差异性,直接产生结果波动。日常质控使用质控血浆时,试剂已经与厂家测定时不是一个批次了,这时血浆的赋值已不再适用。此外,如果质控血浆赋值使用的机型和试剂种类、批号等都不明确,就使赋值区间更是形同虚设了。  

           其次,质控血浆经制造商测定后根据统计学原理提供的检测范围,至少包括了原检测体系下全部测定值的4SD,如果说在这个区间内都视为准确显然不妥。对于这个赋值范围的理解,笔者认为是供用户在使用相同或相似检测体系时选择质控目标区间的一种参考,没有任何靶值的提示或意义。  
      三、关于参数的定量及其参考范围  

           如前所述,常规凝血检验的四个项目中只有Fbg是可以定量的(Clauss法),Clauss法使用的标准曲线可以溯源到国际标准品,可以实现标准化, 而衍生法Fbg定量是根据血浆浊度变化来换算结果,不仅与真实浓度存在偏差而且也不能标准化。国内销售的Fbg定标血浆多数经过WHO参考血浆(如#98/612)校准定值,但是用户在使用时通常不注意试剂批号的变化,造成了实验室之间测定结果的差异。由于实验室很难直接使用国际标准品或参比血浆来校准自己的工作曲线,批号造成的Fbg定量差异不易消除;同时由于Fbg测定试剂是单一凝血酶,每次又是过量使用,所以这种差异还不是很大。PT和APTT的情况则迥然不同,在试剂成份上二者都使用了不同类型的混合物,其中的不同成份对凝血因子的敏感性不同,从而导致使用不同品牌或批号的试剂时,结果出现较大差异,如果与不同原理的凝血仪搭配组合,其波动幅度甚为可观。笔者认为,试剂的特殊性、检测方法和终点判定的差异性从根本上决定了这些指标应用的特异性,也即不同检测体系具有各自独立的参考范围。尽管这些指标是定量的,其量值却不具有溯源性,而且其参考范围具有及时更新的必要性,当仪器维护或校准、试剂批号更换之后,有必要重新确定内部参考范围,这与血细胞计数的要求是完全不同的。 

           如此做法对于临床实验室无论在成本消耗上,还是志愿者选择上都有一定难度,而且频繁变化的参考范围不利于报告解释。在实践中我们不妨沿用正常对照的方法,比如,超出正常对照3秒以上视为PT异常,该对照可以是新鲜血,也可以是冷冻健康人血浆,在一定时限内可以作为正常对照使用。  

           INR作为PT标准化的一种尝试日趋完善,在抗凝治疗中其参考范围已经得到了成熟应用,因此INR这一演算比值及其治疗的预期范围是应该继续沿用的。应该注意的是,基于手工方法的INR报告方式推行以后,自动化凝血仪逐步得到了广泛使用。仪器测试原理与手工法显著不同,对凝血活酶ISI以至INR产生较大的影响而且程度不确定,仪器的广泛使用破坏了INR体系原有的可靠性和精密度。据文献报道,同一厂家的相同机型对INR的影响都显著不同,因此对仪器的校正就显得十分必要。  

           我们必须明确:INR是WHO利用IRP标定凝血活酶试剂后,手工测定PT时优化报告的一种方法和理念。在此基础上可以减少室间差异及提高报告的可比性,凝血活酶校准时要求使用参考品和试管倾斜方法判定结果,然而,将商品化凝血活酶在自动化凝血仪上检测标本时,原理发生了改变,这种校准方法的基础已经不复存在了。这时我们校准的不再仅仅是凝血活酶,而是检测系统—包括凝血活酶和检测技术(仪器)的系统。此外,还要严格限定试剂标识ISI的适用范围。早期试剂的ISI都是针对手工法确定的,为了避免混乱,通过多年研究和专家的倡导,厂家已经开始分别提供针对不同仪器型号的凝血活酶ISI,但是要测定不同仪器和试剂所有组合的各自ISI显然是不可能的;有研究表明,制造商为每一批凝血活酶试剂提供的ISI不一定就是准确的,定标血浆的不当使用将导致INR的校准偏差;这使实验室内部校准显得尤为必要。  

           国外自动化凝血分析仪发展的四十余年是个技术推陈出新、概念提出并不断完善的过程,我国在短时间内完成了设备的升级换代,而在基本概念和应用中还有一些模糊甚至错误的认识和做法。总而言之,虽然凝血检验的结果都是定量指标,但是准确度的概念由于试剂和方法等方面的因素至少在目前还不适于PT、APTT和TT的评价,同时这三个指标也不适于建立或提出通行的参考范围,必要时可参照正常对照标本的测定值进行结果解释。INR的参考范围仅适用于抗凝治疗,而不能在凝血功能筛查时使用。质控血浆作为评估系统稳定性的均一物质,其赋值区间不一定适用于实验室检测体系,不能作为参考物质或标准品使用。  

       

           文章来源:网络转载