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流式细胞仪在血液学检验中的应用

  摘要:流式细胞仪(flow cytometer,FCM)是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。在医学研究领域中,流式细胞仪能够快速分析单个细胞的多种特性,它既可以定性也可以定量,适于大量标本的检测。  

       1973年,美国BD公司与美国斯坦福大学合作,研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。进入90年代,流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻完善,随之而来的就是应用领域的日趋广泛。由于FCM标本要求是单细胞悬液,而血或骨髓有取材方便、利于系列追踪疾病发展等天然优势,因此FCM在血液学中的应用尤为广泛。  

       1、流式细胞仪的工作原理  

       流式细胞仪的结构一般可分为5部分:  

       ①流动室及液流驱动系统;  

       ②激光光源及光束成形系统;  

       ③光学系统;  

       ④信号检测与存贮、显示、分析系统;  

       ⑤细胞分选系统。  

       流式细胞仪可以检测单个细胞的可见光和荧光特性。通过检测细胞大小和内容物等物理特性可以对细胞进行分群。荧光染料可以连接或插入到DNA、RNA等细胞内容物中。另外,荧光染料连接的抗体能够与细胞膜上或其内部的特异蛋白结合。当标记细胞通过光源时,荧光分子被激发到较高的能级。当其回到基态后,荧光染料在较长的波长上释放光能。使用具有相似激发波长、不同发射波长的多种荧光染料,可以同时检测几种细胞特性。  

       在流式细胞仪内,待测细胞在鞘液包裹下单行排列,依次通过检测区域。流式细胞仪通常使用激光作为激发光源,激发光向各个方向散射,通过一系列的滤光片和双色性反光镜的分离,形成不同波长的荧光信号。光信号经光电倍增管接收后转换为电信号,经数/模转换器转换为可被计算机识别的数字信号。检测数据可以以直方图和二维散点图表示出来。  

       2、FCM在血液学中的应用  

       2.1 用于血液/肿瘤细胞增殖动力学研究    细胞经DNA荧光染料如碘化丙啶(PI)、溴化乙啶(EB)、Hoechst等标记后,FCM可测定单个细胞DNA的含量,并描绘出DNA图形,经软件处理可计算出Go/Gi、S、G2/M各细胞周期细胞所占的百分比。依据增殖指数可了解群体细胞的增殖活力。焦宁Y与FITC分别是RNA与蛋白质的特异性染料;PI与FITC双染可测知单个细胞内DNA与蛋白质量的变化;丫啶橙(AO)染色法不仅可测定单个细胞DNA与RNA含量,还可区分出Go与G1期细胞;若丹明123(rhodamin 123)是线粒体特殊染料。通过以上各种特殊染色法,不仅可了解血/肿瘤细胞的增殖状况,更可用于化疗药物作用机制的探讨,从而将其区分为增殖周期特异性、非特异性药物,以及周期时相特异性、非特异性药物,以便更合理的配伍联合化疗方案,预测肿瘤细胞对药物的敏感性等。  

       单参数DNA图形或AO染色DNA/RNA双参数法可显示非整倍体峰,理论上其灵敏度达万分之一。非整倍体细胞是肿瘤细胞的特异标志,在实体瘤中检出率为80% - 90%,在白血病中约为30% - 40%。非整倍体细胞克隆在肿瘤完全缓解期消失,复发前重现。因而FCM-DNA非整倍体测定在肿瘤的诊断、残存肿瘤细胞监测及预示预后中有重要价值。  

       用抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷单抗法可测定细胞倍增时间与各时相时间,用抗周期蛋白单抗可研究周期蛋白对细胞周期的调控。  
  2.2 用于白细胞检测  

       2.2.1 白血病或淋巴瘤免疫分型  

       虽然至今尚未发现白血病或淋巴瘤的特异抗原,更没有各亚型的特异抗原,但根据分化阻抑学说,在白血病或淋巴瘤中,某系列、某分化阶段的细胞必然大大超过正常比例,因此可以利用正常血细胞系列的特异性及分化阶段特异单抗来进行分型。  

       FCM免疫分型有以下优点:  

       2.2.1.1 形态学检查的可靠性取决于检查者的经验,而FCM则是根据特异性单抗客观、快速地确定细胞的来源与性质。比如,FCM可以判断形态学难以分辨的髓系细胞和淋巴细胞,可以分辨T及B淋巴细胞,即FCM免疫分型法可明确区分粒细胞和淋巴细胞白血病,以及T细胞和B细胞性白血病或杂合性白血病。  

       2.2.1.2 对于急性粒细胞白血病亚型的诊断,单纯FCM免疫分型还难以得出肯定的结论,但可提供倾向性参数。比如,CD34+,HLA-DR+者以FAB-M2或M1型可能性大;两者均阴性且CD33+、CD13+者多为FAB-M3型;CD14,CD41则分别是单核细胞与巨核细胞的标志。  

       2.2.1.3 多色荧光标记法可测知一个细胞上是否有共表达的抗原,借此可确定双克隆或双表型白血病。  

       2.2.1.4 联合使用免疫荧光与DNA双染色法,对有非整倍体者可确定其克隆来源。  

       基于上述优点,FCM-免疫分型已成为诊断白血病、淋巴瘤的必要依据。然而血、肿瘤细胞的特性决定了其表型的异质性,因此当出现髓系与淋巴系标志共存时,难以确定是白血病的异质性还是杂合性白血病,但是这种特殊表型可作为残存白血病细胞的标志。 

       2.2.2 用于白细胞分类计数和白血病形态学的分型  

       电阻抗法白细胞"分类"只是根据加入溶血剂后,变化了的白细胞形态的大小。根据电信号进行分析,其只是根据细胞体积大小不同的特征,并未分析细胞核、浆形态特点。因此只能是细胞大小的"分群"而不是分类。  

       流式细胞术是通过激光检测细胞,激光束可直接射入细胞,细胞的核、浆特征不同,给予的检测信号不同,因而可较准确的进行细胞分类。除此以外,有些仪器还可以分析幼稚白细胞,甚至进行白血病分型的初步分析。比如笔者研究证明ADVIA 120血细胞分析仪因为使用细胞化学和激光两种技术进行综合分析,就可以用末梢血(白血病细胞比例> 70%)进行以仪器分析,根据报告的散点图,初步诊断出是淋巴细胞白血病和髓细胞白血病。  

       2.3 免疫功能测定  

       常用的测定是CD3,CD4,CD8,T,B细胞的比例及NK细胞(CD56,CD18)。CD5+B细胞在免疫10 ZHONGGUOYIXUEZHUANGBE性疾病、胶原性疾病中起重要作用;CD4+细胞绝对值小于400/ml是AIDS病的早期表现。  

       2.4 用于网织红细胞分析  

       前已述及,由于激光束可摄入细胞内,因而可进行红细胞内容物的分析,网织红细胞浆内含有一定量的RNA,经染色后可显示网织结构且其形式与RNA含量有关。流式法血细胞分析仪根据这一原理可将网织红细胞分成三群,即早期网织红细胞(HFR),中期网织红细胞(MFR)和晚期网织红细胞(LFR)。这三型网织红细胞比例变化,有以下临床意义:  
 2.4.1 贫血的诊断和鉴别诊断;  

       2.4.2 贫血的疗效观察,凡贫血治疗有效者,笔者动态观察指标变化显示HFR比率的升高可早于Hb变化3-5d,早于MCV变化5-7d。  

       2.4.3 肿瘤治疗过程中,了解骨髓内造血状态。笔者研究表明HFR+MFR的比例变化,可作为了解造血状态的指标。当骨髓造血功能受抑制时,HFR+MFR比例的减低要早于周围血白细胞总数的减少;当骨髓从受抑制状态恢复时,HFR+MFR的比例升高也早于白细胞总数的变化。  

       2.4.4 有些血细胞分析仪除HFR、MFR和LFR以外,还可提供网织红细胞体积、网织红细胞含量、网织红细胞体积分布宽度和网织红细胞血红蛋白浓度等参数,对贫血的诊断、鉴别诊断和疗效观察有一定的意义。  

       2.5 用于网织血小板分析      

       1969年Ingramhe和Coopersmith用美蓝染料对血小板进行染色,发现有些血小板胞浆内有粗糙的呈点状分布的网状物质,他们认为这些物质只是胞浆中残留的mRNA物质被染料着色,因而将这些血小板称为网织血小板(RP)。  

       1990年Kienast等报道利用流式细胞仪检测RP,用荧光染料噻唑橙标记RNA进行分析测定,方法与网织红细胞的FCM测定相似。但由于仪器昂贵,步骤繁琐,没能在临床常规采用。近年来,sysmex生的XE-2100增添了网织血小板检测功能,仅使用少量末梢血,瞬时即可得到红细胞、血小板及血小板多项参数。  

       Rp也与网织红细胞一样都是刚从骨髓中释放出来的未成熟细胞,它与正常血小板相比胞浆内含有少量的mRNA,体积较大,而且有更强的活性,随着血小板的成熟,mRNA逐渐消失,体积逐渐缩小,RP能够比较精确地反映骨髓血小板生成情况,对于血小板方面疾病的诊断和治疗判断具有很好的临床意义:  

       2.5.1 利用Rp%和RP绝对计数结合外周血血小板计数用于血小板减少性疾病的鉴别诊断和治疗效果的监测;  

       2.5.2 通过Rp%和RP绝对计数,用于血小板增生性疾病的鉴别诊断和发生栓塞危险性的判断。  

       2.6 外周血与脐血造血于/祖细胞分选与成份鉴定  

       近年来,外周血造血于/祖细胞移植已在国内外蓬勃发展,并已取得较满意效果。不论是异基因或同基因移植,还是研究利用脐血,为保证尽早达到造血重建和持久的植活,必须有足够数量的于细胞和各期祖细胞。因此,FCM检测CD34+细胞亚类是必不可少的步骤。一般CD34,CD38,HLA-DR,CD33,CD41等组合的双标记法,也只有FCM法能提供最快的信息和最可靠的数据。FCM可从杂合细胞群体中分选出感兴趣的细胞。由于CD34+细胞在骨髓中仅占1% - 3%,在外周血中比例更低,分选既耗时又影响纯度。如果选用免疫磁珠加FCM分选则可达到98% - gg%以上的纯度,并保留细胞活性。    

       总之,FCM经过多年得完善和发展,已由最初的研究应用技术逐渐进入临床应用领域,为疾病诊断提供更为科学的诊断依据。 

   


       文章来源:网络转载

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    流式细胞仪在血液学检验中的应用

      摘要:流式细胞仪(flow cytometer,FCM)是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。在医学研究领域中,流式细胞仪能够快速分析单个细胞的多种特性,它既可以定性也可以定量,适于大量标本的检测。  

           1973年,美国BD公司与美国斯坦福大学合作,研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。进入90年代,流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻完善,随之而来的就是应用领域的日趋广泛。由于FCM标本要求是单细胞悬液,而血或骨髓有取材方便、利于系列追踪疾病发展等天然优势,因此FCM在血液学中的应用尤为广泛。  

           1、流式细胞仪的工作原理  

           流式细胞仪的结构一般可分为5部分:  

           ①流动室及液流驱动系统;  

           ②激光光源及光束成形系统;  

           ③光学系统;  

           ④信号检测与存贮、显示、分析系统;  

           ⑤细胞分选系统。  

           流式细胞仪可以检测单个细胞的可见光和荧光特性。通过检测细胞大小和内容物等物理特性可以对细胞进行分群。荧光染料可以连接或插入到DNA、RNA等细胞内容物中。另外,荧光染料连接的抗体能够与细胞膜上或其内部的特异蛋白结合。当标记细胞通过光源时,荧光分子被激发到较高的能级。当其回到基态后,荧光染料在较长的波长上释放光能。使用具有相似激发波长、不同发射波长的多种荧光染料,可以同时检测几种细胞特性。  

           在流式细胞仪内,待测细胞在鞘液包裹下单行排列,依次通过检测区域。流式细胞仪通常使用激光作为激发光源,激发光向各个方向散射,通过一系列的滤光片和双色性反光镜的分离,形成不同波长的荧光信号。光信号经光电倍增管接收后转换为电信号,经数/模转换器转换为可被计算机识别的数字信号。检测数据可以以直方图和二维散点图表示出来。  

           2、FCM在血液学中的应用  

           2.1 用于血液/肿瘤细胞增殖动力学研究    细胞经DNA荧光染料如碘化丙啶(PI)、溴化乙啶(EB)、Hoechst等标记后,FCM可测定单个细胞DNA的含量,并描绘出DNA图形,经软件处理可计算出Go/Gi、S、G2/M各细胞周期细胞所占的百分比。依据增殖指数可了解群体细胞的增殖活力。焦宁Y与FITC分别是RNA与蛋白质的特异性染料;PI与FITC双染可测知单个细胞内DNA与蛋白质量的变化;丫啶橙(AO)染色法不仅可测定单个细胞DNA与RNA含量,还可区分出Go与G1期细胞;若丹明123(rhodamin 123)是线粒体特殊染料。通过以上各种特殊染色法,不仅可了解血/肿瘤细胞的增殖状况,更可用于化疗药物作用机制的探讨,从而将其区分为增殖周期特异性、非特异性药物,以及周期时相特异性、非特异性药物,以便更合理的配伍联合化疗方案,预测肿瘤细胞对药物的敏感性等。  

           单参数DNA图形或AO染色DNA/RNA双参数法可显示非整倍体峰,理论上其灵敏度达万分之一。非整倍体细胞是肿瘤细胞的特异标志,在实体瘤中检出率为80% - 90%,在白血病中约为30% - 40%。非整倍体细胞克隆在肿瘤完全缓解期消失,复发前重现。因而FCM-DNA非整倍体测定在肿瘤的诊断、残存肿瘤细胞监测及预示预后中有重要价值。  

           用抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷单抗法可测定细胞倍增时间与各时相时间,用抗周期蛋白单抗可研究周期蛋白对细胞周期的调控。  
      2.2 用于白细胞检测  

           2.2.1 白血病或淋巴瘤免疫分型  

           虽然至今尚未发现白血病或淋巴瘤的特异抗原,更没有各亚型的特异抗原,但根据分化阻抑学说,在白血病或淋巴瘤中,某系列、某分化阶段的细胞必然大大超过正常比例,因此可以利用正常血细胞系列的特异性及分化阶段特异单抗来进行分型。  

           FCM免疫分型有以下优点:  

           2.2.1.1 形态学检查的可靠性取决于检查者的经验,而FCM则是根据特异性单抗客观、快速地确定细胞的来源与性质。比如,FCM可以判断形态学难以分辨的髓系细胞和淋巴细胞,可以分辨T及B淋巴细胞,即FCM免疫分型法可明确区分粒细胞和淋巴细胞白血病,以及T细胞和B细胞性白血病或杂合性白血病。  

           2.2.1.2 对于急性粒细胞白血病亚型的诊断,单纯FCM免疫分型还难以得出肯定的结论,但可提供倾向性参数。比如,CD34+,HLA-DR+者以FAB-M2或M1型可能性大;两者均阴性且CD33+、CD13+者多为FAB-M3型;CD14,CD41则分别是单核细胞与巨核细胞的标志。  

           2.2.1.3 多色荧光标记法可测知一个细胞上是否有共表达的抗原,借此可确定双克隆或双表型白血病。  

           2.2.1.4 联合使用免疫荧光与DNA双染色法,对有非整倍体者可确定其克隆来源。  

           基于上述优点,FCM-免疫分型已成为诊断白血病、淋巴瘤的必要依据。然而血、肿瘤细胞的特性决定了其表型的异质性,因此当出现髓系与淋巴系标志共存时,难以确定是白血病的异质性还是杂合性白血病,但是这种特殊表型可作为残存白血病细胞的标志。 

           2.2.2 用于白细胞分类计数和白血病形态学的分型  

           电阻抗法白细胞"分类"只是根据加入溶血剂后,变化了的白细胞形态的大小。根据电信号进行分析,其只是根据细胞体积大小不同的特征,并未分析细胞核、浆形态特点。因此只能是细胞大小的"分群"而不是分类。  

           流式细胞术是通过激光检测细胞,激光束可直接射入细胞,细胞的核、浆特征不同,给予的检测信号不同,因而可较准确的进行细胞分类。除此以外,有些仪器还可以分析幼稚白细胞,甚至进行白血病分型的初步分析。比如笔者研究证明ADVIA 120血细胞分析仪因为使用细胞化学和激光两种技术进行综合分析,就可以用末梢血(白血病细胞比例> 70%)进行以仪器分析,根据报告的散点图,初步诊断出是淋巴细胞白血病和髓细胞白血病。  

           2.3 免疫功能测定  

           常用的测定是CD3,CD4,CD8,T,B细胞的比例及NK细胞(CD56,CD18)。CD5+B细胞在免疫10 ZHONGGUOYIXUEZHUANGBE性疾病、胶原性疾病中起重要作用;CD4+细胞绝对值小于400/ml是AIDS病的早期表现。  

           2.4 用于网织红细胞分析  

           前已述及,由于激光束可摄入细胞内,因而可进行红细胞内容物的分析,网织红细胞浆内含有一定量的RNA,经染色后可显示网织结构且其形式与RNA含量有关。流式法血细胞分析仪根据这一原理可将网织红细胞分成三群,即早期网织红细胞(HFR),中期网织红细胞(MFR)和晚期网织红细胞(LFR)。这三型网织红细胞比例变化,有以下临床意义:  
     2.4.1 贫血的诊断和鉴别诊断;  

           2.4.2 贫血的疗效观察,凡贫血治疗有效者,笔者动态观察指标变化显示HFR比率的升高可早于Hb变化3-5d,早于MCV变化5-7d。  

           2.4.3 肿瘤治疗过程中,了解骨髓内造血状态。笔者研究表明HFR+MFR的比例变化,可作为了解造血状态的指标。当骨髓造血功能受抑制时,HFR+MFR比例的减低要早于周围血白细胞总数的减少;当骨髓从受抑制状态恢复时,HFR+MFR的比例升高也早于白细胞总数的变化。  

           2.4.4 有些血细胞分析仪除HFR、MFR和LFR以外,还可提供网织红细胞体积、网织红细胞含量、网织红细胞体积分布宽度和网织红细胞血红蛋白浓度等参数,对贫血的诊断、鉴别诊断和疗效观察有一定的意义。  

           2.5 用于网织血小板分析      

           1969年Ingramhe和Coopersmith用美蓝染料对血小板进行染色,发现有些血小板胞浆内有粗糙的呈点状分布的网状物质,他们认为这些物质只是胞浆中残留的mRNA物质被染料着色,因而将这些血小板称为网织血小板(RP)。  

           1990年Kienast等报道利用流式细胞仪检测RP,用荧光染料噻唑橙标记RNA进行分析测定,方法与网织红细胞的FCM测定相似。但由于仪器昂贵,步骤繁琐,没能在临床常规采用。近年来,sysmex生的XE-2100增添了网织血小板检测功能,仅使用少量末梢血,瞬时即可得到红细胞、血小板及血小板多项参数。  

           Rp也与网织红细胞一样都是刚从骨髓中释放出来的未成熟细胞,它与正常血小板相比胞浆内含有少量的mRNA,体积较大,而且有更强的活性,随着血小板的成熟,mRNA逐渐消失,体积逐渐缩小,RP能够比较精确地反映骨髓血小板生成情况,对于血小板方面疾病的诊断和治疗判断具有很好的临床意义:  

           2.5.1 利用Rp%和RP绝对计数结合外周血血小板计数用于血小板减少性疾病的鉴别诊断和治疗效果的监测;  

           2.5.2 通过Rp%和RP绝对计数,用于血小板增生性疾病的鉴别诊断和发生栓塞危险性的判断。  

           2.6 外周血与脐血造血于/祖细胞分选与成份鉴定  

           近年来,外周血造血于/祖细胞移植已在国内外蓬勃发展,并已取得较满意效果。不论是异基因或同基因移植,还是研究利用脐血,为保证尽早达到造血重建和持久的植活,必须有足够数量的于细胞和各期祖细胞。因此,FCM检测CD34+细胞亚类是必不可少的步骤。一般CD34,CD38,HLA-DR,CD33,CD41等组合的双标记法,也只有FCM法能提供最快的信息和最可靠的数据。FCM可从杂合细胞群体中分选出感兴趣的细胞。由于CD34+细胞在骨髓中仅占1% - 3%,在外周血中比例更低,分选既耗时又影响纯度。如果选用免疫磁珠加FCM分选则可达到98% - gg%以上的纯度,并保留细胞活性。    

           总之,FCM经过多年得完善和发展,已由最初的研究应用技术逐渐进入临床应用领域,为疾病诊断提供更为科学的诊断依据。 

       


           文章来源:网络转载