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芯片 VS 测序

在高通量检测这个领域里,基因芯片和二代测序这对相爱相杀的cp,原本均是了解基因组结构和功能的绝佳高手,如今为了一争高下,又是闹的不开交。


这不,基因芯片仗着自己老大哥的身份,手持一个二维的DNA探针阵列所形成的三维地图,以数以万计的探针做方向标,能按图索骥的找到基因组的特定位置,且结合完整成熟的指控分析手段能快狠准地筛选出所需基因,颇有几分笑傲江湖的气势。


芯片测序图一.jpg


然而,RNA测序技术作为后起之秀,不仅能轻而易举地解读由转录组组成的生命杂志,就连探索新的突变位点以及新基因之事也都不在话下。这锋芒毕露的架势,显然来势汹汹,眼瞅着就要把这些年略显沉寂的芯片老大哥给打压下去,成为高通量领域里独霸一方的势力了。


芯片测序图二.jpg


至此,进入看戏模式的吃瓜群众—科研者们,虽然表面看的热闹,其实内心深处也颇为纠结,万一哪天真要战队,我该支持谁呢?芯片与测序各有所长,均可大放异彩,到底谁才是笑到最后的那一个呢?


芯片vs测序,各领风骚

BMC Genomics 的一篇文章,似乎能为一众心有存疑的科研者们指点迷津。它以9对肺鳞状细胞癌配对样本为材料,分别用Affymetrix HumanTranscriptome Arrays 2.0 (HTA)(最新一代全转录本表达谱芯片)和IlluminaHiSeq 2000检测平台,以测序200 M reads为基础,深入比较了芯片和测序在转录本定量检测和可变剪切方面的情况。


芯片测序图三.jpg


首先,就检测基因覆盖范围而言,芯片和测序均可检测到Ensembl数据库中92%的mRNA和90%的lncRNA,可以说是不相上下,打成平局。


芯片测序图四.jpg


而在正常和肿瘤组织生物学重复比较分析,发现在低表达基因上,RNA-seq检测的样本可变性更大,而芯片则没有表达高低的偏好性,说明HTA芯片的稳定性比RNA-Seq更好。


芯片测序图五.jpg


至于灵敏度,依据检测信号分布强度(log2 intensity values),HTA的变化范围在3到13之间,而RNA-seq则在-1到14之间,其动态范围更大,可减少一些漏网之鱼,然而对于一些短片度基因,却是芯片的检测效果更好一些。


芯片测序图六.jpg芯片测序图七.jpg


而非配对差异分析结果中,在mRNA差异检出数量中,HTA对比RNA-seq分别是6173和4777(3683为共有);在lncRNA差异检出数量中,HTA对比RNA-seq分别是1219和892(376为共有)。显然,对同样疾病样本在TCGA上的数据分析比较,差异基因中,无论是mRNA,还是lncRNA,芯片与TCGA吻合的基因数量更多。另外,欲寻找疾病诊断标记物的小伙伴可要记住了,无论是mRNA或者lncRNA,HTA平台有更多的基因可作为biomarker。


芯片测序图八.jpg


可变剪切分析是识别基因不同转录本特异性表达的有效手段。其中,RNA-seq可鉴定到23,934个差异exons,HTA鉴定到26,999个差异exons(3698个共有)。Junctions差异鉴定,RNA-seq为7063个,HTA为40,384个(1551个共有)。


芯片测序图九.jpg


综合两者分析显示,只有207个mRNAs的可变剪切结果在两个平台能同时出现。


芯片测序图十.jpg


总体来说,这两种技术各有千秋,各具特色,在应用方面也可以说是平分秋色,各领风骚。简单说来,两者都在为筛选目的基因添砖加瓦,既如此,何不都拿来为我所用呢。更何况,有时强强联手,反而会碰撞出美丽的火花,说不定还会产生翻倍的效果。


芯片联手测序之案例分析

于是,有些雷厉风行的研究者就立刻行动起来。这不,Nature Communications的一篇研究肝纤维化(肝内细胞外间质成分ECM积累造成)文章就充分向大家展示了,芯片在与测序联手后,是如何玩转对下游靶基因的筛选,进而完美实现了两手都要抓,两手都要硬的大纲领。


1.基因芯片打头阵,筛出肝纤维化相关lncRNA

在构建肝纤维化的小鼠模型后,通过基因芯片筛选共得到了266个lncRNA和1007个mRNA上调,447个lncRNA和519个mRNA下调。基于共表达分析和RT-PCR验证,研究人员筛选到了NONMMUT013861等10个与CCl4诱导肝纤维化相关的lncRNA。而经验证,只有lncRNA—lnc-LFAR1是在肝脏中特异性表达的。


芯片测序11.jpg


2.RNA-seq送助力,筛选下游靶基因

在肝纤维化过程中,肝星形细胞(HSCs)的激活至关重要。因而,研究者探索了lnc-LFAR1在HSCs中的下游调控基因,即用shRNAs敲降了lnc-LFAR1后,二代测序筛选下游差异变化基因。


芯片测序12.jpg


通过对差异的2023个mRNA的GO与KEGG通路富集,发现主要富集到ECM过程基因和ECM-受体作用通路。显然,在HSCs中,lnc-LFAR1调控了ECM基因。


3.基因芯片再出马,体内变化基因跑不了

研究者已然证明了敲降lnc-LFAR1后影响TGFβ诱导的HCs凋亡,为了验证体内基因的相关变化,先在小鼠中shLFAR1干扰其表达,CCl4诱导肝纤维化,基因芯片筛选下游变化mRNA。


芯片测序13.jpg


结果显示,小鼠体内lnc-LFAR1的低表达,使得肝细胞在CCL4诱导下,其下游变化的基因显著减少,只有292个上调,112个下调。GO和KEGG 通路分析也显示,lnc-LFAR1沉默影响的下游基因主要是胶原纤维组织和 TGFβ 受体信号通路,并进一步确定了 lnc-LFAR1的敲降使得CCl4和BDL诱导的肝纤维化会被显著减弱。至此,芯片与测序的轮番出击,体内外实验的联合轰炸,使得lnc-LFAR1在肝纤维过程发挥作用成为了一件板上钉钉的事儿了。至于下游所发生的具体作用机制,文章中也通过了大量实验对其进行了阐释,并获得以下信号通路图。


芯片测序14.jpg


其中,lnc-LFAR1与磷酸化Smad2/3之间存在正反馈,并会调控胞内notch、炎症和凋亡相关等信号通路,进而调节肝纤维化过程。此时,文章才算讲述了一个完整的故事。显然,故事中测序与芯片无疑为筛选该故事的主角和下游基因的筛选起到了举足轻重的作用。


所以,各位小伙伴们,争议这两个技术孰优孰劣,真的没有意义。毕竟,“黑猫,白猫,能抓老鼠的就是好猫”,既然两只猫都能抓到老鼠,又何必在意它的颜色呢。至于实际实验操作中,是在两者之间有所取舍,又或是两者结合使用,小编的建议是,选择对的就好。只有两个都用过了,你才会知道谁更适合自己。


参考文献1. RNAsequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results foralternative splicing in patient derived samples (DOI 10.1186/s12864-017-3819-y )

2. The liver-enriched lnc-LFAR1 promotes liverfibrosis by activating TGFβ and Notch pathways (DOI: 10.1038/s41467-017-00204-4)

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    芯片 VS 测序

    在高通量检测这个领域里,基因芯片和二代测序这对相爱相杀的cp,原本均是了解基因组结构和功能的绝佳高手,如今为了一争高下,又是闹的不开交。


    这不,基因芯片仗着自己老大哥的身份,手持一个二维的DNA探针阵列所形成的三维地图,以数以万计的探针做方向标,能按图索骥的找到基因组的特定位置,且结合完整成熟的指控分析手段能快狠准地筛选出所需基因,颇有几分笑傲江湖的气势。


    芯片测序图一.jpg


    然而,RNA测序技术作为后起之秀,不仅能轻而易举地解读由转录组组成的生命杂志,就连探索新的突变位点以及新基因之事也都不在话下。这锋芒毕露的架势,显然来势汹汹,眼瞅着就要把这些年略显沉寂的芯片老大哥给打压下去,成为高通量领域里独霸一方的势力了。


    芯片测序图二.jpg


    至此,进入看戏模式的吃瓜群众—科研者们,虽然表面看的热闹,其实内心深处也颇为纠结,万一哪天真要战队,我该支持谁呢?芯片与测序各有所长,均可大放异彩,到底谁才是笑到最后的那一个呢?


    芯片vs测序,各领风骚

    BMC Genomics 的一篇文章,似乎能为一众心有存疑的科研者们指点迷津。它以9对肺鳞状细胞癌配对样本为材料,分别用Affymetrix HumanTranscriptome Arrays 2.0 (HTA)(最新一代全转录本表达谱芯片)和IlluminaHiSeq 2000检测平台,以测序200 M reads为基础,深入比较了芯片和测序在转录本定量检测和可变剪切方面的情况。


    芯片测序图三.jpg


    首先,就检测基因覆盖范围而言,芯片和测序均可检测到Ensembl数据库中92%的mRNA和90%的lncRNA,可以说是不相上下,打成平局。


    芯片测序图四.jpg


    而在正常和肿瘤组织生物学重复比较分析,发现在低表达基因上,RNA-seq检测的样本可变性更大,而芯片则没有表达高低的偏好性,说明HTA芯片的稳定性比RNA-Seq更好。


    芯片测序图五.jpg


    至于灵敏度,依据检测信号分布强度(log2 intensity values),HTA的变化范围在3到13之间,而RNA-seq则在-1到14之间,其动态范围更大,可减少一些漏网之鱼,然而对于一些短片度基因,却是芯片的检测效果更好一些。


    芯片测序图六.jpg芯片测序图七.jpg


    而非配对差异分析结果中,在mRNA差异检出数量中,HTA对比RNA-seq分别是6173和4777(3683为共有);在lncRNA差异检出数量中,HTA对比RNA-seq分别是1219和892(376为共有)。显然,对同样疾病样本在TCGA上的数据分析比较,差异基因中,无论是mRNA,还是lncRNA,芯片与TCGA吻合的基因数量更多。另外,欲寻找疾病诊断标记物的小伙伴可要记住了,无论是mRNA或者lncRNA,HTA平台有更多的基因可作为biomarker。


    芯片测序图八.jpg


    可变剪切分析是识别基因不同转录本特异性表达的有效手段。其中,RNA-seq可鉴定到23,934个差异exons,HTA鉴定到26,999个差异exons(3698个共有)。Junctions差异鉴定,RNA-seq为7063个,HTA为40,384个(1551个共有)。


    芯片测序图九.jpg


    综合两者分析显示,只有207个mRNAs的可变剪切结果在两个平台能同时出现。


    芯片测序图十.jpg


    总体来说,这两种技术各有千秋,各具特色,在应用方面也可以说是平分秋色,各领风骚。简单说来,两者都在为筛选目的基因添砖加瓦,既如此,何不都拿来为我所用呢。更何况,有时强强联手,反而会碰撞出美丽的火花,说不定还会产生翻倍的效果。


    芯片联手测序之案例分析

    于是,有些雷厉风行的研究者就立刻行动起来。这不,Nature Communications的一篇研究肝纤维化(肝内细胞外间质成分ECM积累造成)文章就充分向大家展示了,芯片在与测序联手后,是如何玩转对下游靶基因的筛选,进而完美实现了两手都要抓,两手都要硬的大纲领。


    1.基因芯片打头阵,筛出肝纤维化相关lncRNA

    在构建肝纤维化的小鼠模型后,通过基因芯片筛选共得到了266个lncRNA和1007个mRNA上调,447个lncRNA和519个mRNA下调。基于共表达分析和RT-PCR验证,研究人员筛选到了NONMMUT013861等10个与CCl4诱导肝纤维化相关的lncRNA。而经验证,只有lncRNA—lnc-LFAR1是在肝脏中特异性表达的。


    芯片测序11.jpg


    2.RNA-seq送助力,筛选下游靶基因

    在肝纤维化过程中,肝星形细胞(HSCs)的激活至关重要。因而,研究者探索了lnc-LFAR1在HSCs中的下游调控基因,即用shRNAs敲降了lnc-LFAR1后,二代测序筛选下游差异变化基因。


    芯片测序12.jpg


    通过对差异的2023个mRNA的GO与KEGG通路富集,发现主要富集到ECM过程基因和ECM-受体作用通路。显然,在HSCs中,lnc-LFAR1调控了ECM基因。


    3.基因芯片再出马,体内变化基因跑不了

    研究者已然证明了敲降lnc-LFAR1后影响TGFβ诱导的HCs凋亡,为了验证体内基因的相关变化,先在小鼠中shLFAR1干扰其表达,CCl4诱导肝纤维化,基因芯片筛选下游变化mRNA。


    芯片测序13.jpg


    结果显示,小鼠体内lnc-LFAR1的低表达,使得肝细胞在CCL4诱导下,其下游变化的基因显著减少,只有292个上调,112个下调。GO和KEGG 通路分析也显示,lnc-LFAR1沉默影响的下游基因主要是胶原纤维组织和 TGFβ 受体信号通路,并进一步确定了 lnc-LFAR1的敲降使得CCl4和BDL诱导的肝纤维化会被显著减弱。至此,芯片与测序的轮番出击,体内外实验的联合轰炸,使得lnc-LFAR1在肝纤维过程发挥作用成为了一件板上钉钉的事儿了。至于下游所发生的具体作用机制,文章中也通过了大量实验对其进行了阐释,并获得以下信号通路图。


    芯片测序14.jpg


    其中,lnc-LFAR1与磷酸化Smad2/3之间存在正反馈,并会调控胞内notch、炎症和凋亡相关等信号通路,进而调节肝纤维化过程。此时,文章才算讲述了一个完整的故事。显然,故事中测序与芯片无疑为筛选该故事的主角和下游基因的筛选起到了举足轻重的作用。


    所以,各位小伙伴们,争议这两个技术孰优孰劣,真的没有意义。毕竟,“黑猫,白猫,能抓老鼠的就是好猫”,既然两只猫都能抓到老鼠,又何必在意它的颜色呢。至于实际实验操作中,是在两者之间有所取舍,又或是两者结合使用,小编的建议是,选择对的就好。只有两个都用过了,你才会知道谁更适合自己。


    参考文献1. RNAsequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results foralternative splicing in patient derived samples (DOI 10.1186/s12864-017-3819-y )

    2. The liver-enriched lnc-LFAR1 promotes liverfibrosis by activating TGFβ and Notch pathways (DOI: 10.1038/s41467-017-00204-4)