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量子点的应用——一种新型的荧光定量检测平台

半导体量子点,简称量子点(quantum dots, QDS),即材料的尺寸在三维空间进行约束并达到一定的临界尺寸(可抽象为一个点),因此其表现出许多独特的光、电特性,特别是II-VI族荧光量子点(如CdS、CdSe、CdTe等),一直以来都是人们研究的热点[1]。

传统上,这些材料一般用于电子、物理和材料工程领域,而1998年美国加州伯克利大学的Alivisatos小组[2]和印第安纳大学Nie小组[3]几乎同时提出荧光量子点可应用于生物标记这一思想,并同时在《Science》发表了相应的研究结果,开创了荧光量子点在生物技术中研究应用的先河。直到2015年深圳市金准生物医学工程有限公司研发的降钙素原(PCT)定量测定试剂盒(量子点(QD)免疫荧光层析法)——国内唯一一家成功实现产业化并取得注册证号(粤械注准20152400386)的量子点临床检测试剂的出现,量子点材料的应用第一次从实验室华丽转身成为医疗器械产品,造福社会。本文将重点综述量子点的特性及其在荧光定量检测应用中的研究进展,并对其在医疗领域检测方面的发展前景予以展望。

1 量子家族的新贵——量子点 
量子点(quantum dot, QD)又可称为半导体纳米微晶体(semiconductor nanocrystal),是一种由II-VI族或III-V族元素组成的稳定的、溶于水的、尺寸在2~20nm之间的纳米晶粒。目前研究较多的是CdS、CdSe、CdTe、ZnS等。近年来,半导体量子点由于其独特的性质越来越受到人们的重视,其研究内容涉及物理、化学、材料、生物等多学科,已成为一门新兴的交叉学科。

2 与普通的荧光染料相比较[4],量子点具有以下特点:
(1) 有机染料荧光分子激光谱带较窄,每一种荧光分子必须用合适能量的光来激发,而且产生的荧光峰较宽,不对称,有些拖尾。这给区分不同的探针分子带来困难,很难利用有机染料分子同时检测多种组分。量子点由于量子限域效应使其激发波长的范围很宽,可以被波长短于发射光的光(一般短10nm以上)激发,并产生窄(半波宽约13nm)而对称的发射光谱,从而避免了相邻探测通道的串扰。

(2) 量子点具有"调色"功能,不同粒径大小的量子点具有不同的颜色,激发量子点的激发波长范围很宽,且连续分布,所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记,是一类理想的荧光探针。

(3)量子点的荧光强度强,稳定性好,抗漂白能力强,Chan和Nie通过实验证明ZnS包覆的CdSe比罗丹明6G分子要亮20倍和稳定100-200倍,可以经受多次激发,且标记后对生物大分子的生理活性影响很小,因此为研究生物大分子之间的长期作用提供了可能。

(4)生物相容性好,尤其是经过各种化学修饰之后,可以进行特异性连接,细胞毒性低,对生物体危害小,可进行生物活体标记和检测,而传统的有机荧光染料一般毒性较大,生物相容性差。

(5)荧光寿命长,典型的有机荧光染料的荧光寿命仅为几纳秒(ns),这与很多样本的自发荧光衰减的时间相当。而量子点的荧光寿命可持续长达数十纳秒(20ns-50ns),这使得当光激发数纳秒以后,大多数的自发荧光背景已经衰减,而量子点荧光仍然存在,此时即可获得无背景干扰的荧光信号。

3 量子点在荧光检测中的应用
量子点免疫层析技术利用量子点荧光探针做为标记物,不仅充分体现了免疫层析技术的简便,快速,特异性强的优点,而且展示了量子点的高灵敏度,以及它的荧光特性,显示出巨大的发展潜力和广阔的应用前景。吸附了配体(抗体)的量子点可以高特异性地与靶受体结合,进而该受体由于被荧光标记而被观测到。当量子点吸附不同抗体时,可以特异性地标记不同的受体。

最早的标记试验是1998年由Bruchez小组完成的,该课题组用两种粒径的CdSe-CdS量子点分别标记鼠的成纤维细胞的细胞核和肌动蛋白纤维,一种发绿色荧光,一种发红色荧光,并且将发红光的量子点特异性地标记在肌动蛋白丝上,而发绿光的量子点与尿素和乙酸结合,使量子点与细胞核具有高亲和力,可以同时在细胞中观察到红色和绿色的荧光[2]。2003年Wu等采用荧光免疫法,利用直径在7.4~10nm的CdSe/ZnS量子点标记了细胞。与有机荧光染料Alexa488比较,量子点发射的荧光较强且稳定性好[5]。2006年Chen等运用CdS/PPA量子点标记蛋白实现了HAS和IgG的快速检测。该方法采用功能化的羟基基团增加了量子点的水溶性和生物相容性[6]。2007年Jaiswal等首先用二氢硫辛酸对CdSe/ZnS量子点进行修饰,然后与P糖蛋白抗体结合,对培养中的Hela细胞和D.discoideum细胞表面的P糖蛋白进行了标记。结果表明,进入细胞的量子点不影响细胞的正常生长和功能,而且标记后量子点荧光相当稳定,持续12d仍能看到量子点的荧光。因此量子点可以用来制备追踪标记分子,用于细胞生长过程中的动态研究[7]。

4 量子点在荧光检测中的前景和展望
随着量子点的制备技术和偶联技术的不断完善以及商品化量子点产品的推出,量子点在各个生命科学领域的应用程度势必大大加强,应用范围势必大大拓宽。由于量子点优越的荧光性能,高的荧光强度及良好的光稳定性,对于建立稳定及高灵敏的荧光定量检测方法 具有极高的应用前景。总而言之,一个新的材料的出现一定会给各种领域难以解决的问题带来新的希望,在不久的将来,人们一定会更好地利用荧光量子点的各种特性,在越来越多的研究领域取得更大的突破。

参考文献
[1]杨文胜,高明远,白玉白等.纳米材料与生物技术[M].北京:化学工业出版社,2005.25-38.

[2]Bruchez M J,Moronne M,Gin p,et al.Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels[J].Science,1998,281:2013-2016.

[3]Chan W C,Nie S.Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection[J].Science,1998,281:2016-2018.

[4]Larson D R,Zipfel W R,Williams R M,et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo.Science,2003,300(5624):1434-1436.

[5]Wu X,Liu H,Liu J,et al.Immunofluorescent labeling of cancer marker her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots[J].Nat Biotechnol,2003,21(1):41-46.

[6]Chen H Q,Wang L,Liu Y,et al.Preparation of a novel composite particles and its application in the fluorescent detection of proteins[J].Anal Bioanal Chem,2006,385(8):1457-1461.

[7]Jaiswal J K,Mattoussi H, Mauro J M,et al.Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates[J].Nature Biotechnology 2003,21(1):47-51.
 

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    量子点的应用——一种新型的荧光定量检测平台

    半导体量子点,简称量子点(quantum dots, QDS),即材料的尺寸在三维空间进行约束并达到一定的临界尺寸(可抽象为一个点),因此其表现出许多独特的光、电特性,特别是II-VI族荧光量子点(如CdS、CdSe、CdTe等),一直以来都是人们研究的热点[1]。

    传统上,这些材料一般用于电子、物理和材料工程领域,而1998年美国加州伯克利大学的Alivisatos小组[2]和印第安纳大学Nie小组[3]几乎同时提出荧光量子点可应用于生物标记这一思想,并同时在《Science》发表了相应的研究结果,开创了荧光量子点在生物技术中研究应用的先河。直到2015年深圳市金准生物医学工程有限公司研发的降钙素原(PCT)定量测定试剂盒(量子点(QD)免疫荧光层析法)——国内唯一一家成功实现产业化并取得注册证号(粤械注准20152400386)的量子点临床检测试剂的出现,量子点材料的应用第一次从实验室华丽转身成为医疗器械产品,造福社会。本文将重点综述量子点的特性及其在荧光定量检测应用中的研究进展,并对其在医疗领域检测方面的发展前景予以展望。

    1 量子家族的新贵——量子点 
    量子点(quantum dot, QD)又可称为半导体纳米微晶体(semiconductor nanocrystal),是一种由II-VI族或III-V族元素组成的稳定的、溶于水的、尺寸在2~20nm之间的纳米晶粒。目前研究较多的是CdS、CdSe、CdTe、ZnS等。近年来,半导体量子点由于其独特的性质越来越受到人们的重视,其研究内容涉及物理、化学、材料、生物等多学科,已成为一门新兴的交叉学科。

    2 与普通的荧光染料相比较[4],量子点具有以下特点:
    (1) 有机染料荧光分子激光谱带较窄,每一种荧光分子必须用合适能量的光来激发,而且产生的荧光峰较宽,不对称,有些拖尾。这给区分不同的探针分子带来困难,很难利用有机染料分子同时检测多种组分。量子点由于量子限域效应使其激发波长的范围很宽,可以被波长短于发射光的光(一般短10nm以上)激发,并产生窄(半波宽约13nm)而对称的发射光谱,从而避免了相邻探测通道的串扰。

    (2) 量子点具有"调色"功能,不同粒径大小的量子点具有不同的颜色,激发量子点的激发波长范围很宽,且连续分布,所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记,是一类理想的荧光探针。

    (3)量子点的荧光强度强,稳定性好,抗漂白能力强,Chan和Nie通过实验证明ZnS包覆的CdSe比罗丹明6G分子要亮20倍和稳定100-200倍,可以经受多次激发,且标记后对生物大分子的生理活性影响很小,因此为研究生物大分子之间的长期作用提供了可能。

    (4)生物相容性好,尤其是经过各种化学修饰之后,可以进行特异性连接,细胞毒性低,对生物体危害小,可进行生物活体标记和检测,而传统的有机荧光染料一般毒性较大,生物相容性差。

    (5)荧光寿命长,典型的有机荧光染料的荧光寿命仅为几纳秒(ns),这与很多样本的自发荧光衰减的时间相当。而量子点的荧光寿命可持续长达数十纳秒(20ns-50ns),这使得当光激发数纳秒以后,大多数的自发荧光背景已经衰减,而量子点荧光仍然存在,此时即可获得无背景干扰的荧光信号。

    3 量子点在荧光检测中的应用
    量子点免疫层析技术利用量子点荧光探针做为标记物,不仅充分体现了免疫层析技术的简便,快速,特异性强的优点,而且展示了量子点的高灵敏度,以及它的荧光特性,显示出巨大的发展潜力和广阔的应用前景。吸附了配体(抗体)的量子点可以高特异性地与靶受体结合,进而该受体由于被荧光标记而被观测到。当量子点吸附不同抗体时,可以特异性地标记不同的受体。

    最早的标记试验是1998年由Bruchez小组完成的,该课题组用两种粒径的CdSe-CdS量子点分别标记鼠的成纤维细胞的细胞核和肌动蛋白纤维,一种发绿色荧光,一种发红色荧光,并且将发红光的量子点特异性地标记在肌动蛋白丝上,而发绿光的量子点与尿素和乙酸结合,使量子点与细胞核具有高亲和力,可以同时在细胞中观察到红色和绿色的荧光[2]。2003年Wu等采用荧光免疫法,利用直径在7.4~10nm的CdSe/ZnS量子点标记了细胞。与有机荧光染料Alexa488比较,量子点发射的荧光较强且稳定性好[5]。2006年Chen等运用CdS/PPA量子点标记蛋白实现了HAS和IgG的快速检测。该方法采用功能化的羟基基团增加了量子点的水溶性和生物相容性[6]。2007年Jaiswal等首先用二氢硫辛酸对CdSe/ZnS量子点进行修饰,然后与P糖蛋白抗体结合,对培养中的Hela细胞和D.discoideum细胞表面的P糖蛋白进行了标记。结果表明,进入细胞的量子点不影响细胞的正常生长和功能,而且标记后量子点荧光相当稳定,持续12d仍能看到量子点的荧光。因此量子点可以用来制备追踪标记分子,用于细胞生长过程中的动态研究[7]。

    4 量子点在荧光检测中的前景和展望
    随着量子点的制备技术和偶联技术的不断完善以及商品化量子点产品的推出,量子点在各个生命科学领域的应用程度势必大大加强,应用范围势必大大拓宽。由于量子点优越的荧光性能,高的荧光强度及良好的光稳定性,对于建立稳定及高灵敏的荧光定量检测方法 具有极高的应用前景。总而言之,一个新的材料的出现一定会给各种领域难以解决的问题带来新的希望,在不久的将来,人们一定会更好地利用荧光量子点的各种特性,在越来越多的研究领域取得更大的突破。

    参考文献
    [1]杨文胜,高明远,白玉白等.纳米材料与生物技术[M].北京:化学工业出版社,2005.25-38.

    [2]Bruchez M J,Moronne M,Gin p,et al.Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels[J].Science,1998,281:2013-2016.

    [3]Chan W C,Nie S.Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection[J].Science,1998,281:2016-2018.

    [4]Larson D R,Zipfel W R,Williams R M,et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo.Science,2003,300(5624):1434-1436.

    [5]Wu X,Liu H,Liu J,et al.Immunofluorescent labeling of cancer marker her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots[J].Nat Biotechnol,2003,21(1):41-46.

    [6]Chen H Q,Wang L,Liu Y,et al.Preparation of a novel composite particles and its application in the fluorescent detection of proteins[J].Anal Bioanal Chem,2006,385(8):1457-1461.

    [7]Jaiswal J K,Mattoussi H, Mauro J M,et al.Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates[J].Nature Biotechnology 2003,21(1):47-51.