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新型芯片传感-微分电位溶出法测定血铅的探讨

辛君伟1,2  盛青松1,2

(1.无锡市申瑞生物制品有限公司,江苏无锡,214092;

  2.江苏省丝网印刷电极式生物传感器工程技术研究中心,江苏无锡,214092)

摘要:

     评价芯片传感-微分电位溶出法在临床血铅检测的准确度和重复性,并与氢化物发生原子荧光法比较,为临床选择检测方法提供参考依据。分别运用芯片传感-微分电位溶出法和氢化物发生原子荧光法同时检测血液样本和标准物质(为2011年全国血铅检测室间质评用血),评价芯片传感-微分电位溶出法的正确度、重复性、回收率、可报告范围和符合率。以靶值±10%作为允许误差,6种标准物质的芯片传感-微分电位溶出法测定结果与靶值比较,均在允许误差范围之内,正确度良好;低、中、高3个水平样本的相对标准偏差(RSD)分别为6.98%、4.09%、2.78%;平均回收率为98.1%,系统比例误差为1.9%;与氢化物发生原子荧光法比较,结果差异无统计学意义(P>0.05),线性回归分析相关系数(R2)=0.964,2种方法测定结果的符合度为96.4%。 芯片传感-微分电位溶出法准确度高,重复性好,精密度佳,是一种适用于临床血铅检测的快捷、准确、方便的方法。

关键词:血铅;芯片传感器;微分电位溶出法;氢化物发生原子荧光光谱法

     铅是具神经毒性的重金属元素。铅在体内含量超过一定水平就会对健康引起难以恢复的损害。铅中毒已成为发展中国家儿童面临的突出环境问题[1-2]。血铅检测是了解人体铅污染的最佳途径。卫生部已于2006年明确规定临床测定血液中铅浓度的基本方法为石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)和微分电位溶出法(DPSA)。这两种方法虽然具备了良好的灵敏度,但是都需要较为复杂的样本前处理和较高的仪器要求[3-5]。

     近年来,无锡市申瑞生物制品有限公司在国内外最新研究进展[6-7]的基础上,通过建立合适的样本前处理方法并优化反应条件,将新型丝印传感器应用于微分电位溶出法(DPSA)检测,开发出了全新的血铅检测仪。我们对该仪器进行了方法学性能评价,并与氢化物发生原子荧光法进行比对。

材料和方法

一、仪器及试剂 

     1. 芯片传感-微分电位溶出法 SR-P-100血铅专用型微量元素检测仪及配套试剂,由无锡市申瑞生物制品有限公司提供。

    2. 氢化物发生原子荧光法 AF-610B原子荧光分析仪,由北京瑞利公司生产。

二、方法

    1. 芯片传感-微分电位溶出法原理   该法利用微分电位溶出法(DPSA)和丝印传感器来测试血液中铅含量。人体血液中90%左右的铅在红细胞内。当血样和样本处理管中的处理液混合后,红细胞在强电解质的影响下破裂,具备电化学活性的铅裂解出来。当测试开始后,血样中的铅离子在一定的电位下,会富集在传感器上,这个过程是铅离子富集过程,也是微分电位溶出可以检测痕量铅的原因。撤除电位后,溶液中的氧化剂使镀在传感器上铅溶出到溶液中,记录下溶出过程中电位-时间曲线,找出电位变化和铅离子浓度关系后即可计算出样本中的铅离子浓度。

    2. 血液采集 成人采集静脉血,EDTA-K2抗凝;儿童采集末梢血,采用0.5%硝酸棉球→75%酒精棉球→干棉球处理采血部位后采集血液。

    3. 样本前处理 (1) 打开样本处理管的盖子,将20 μL末梢血或EDTA-K2抗凝血转移到已预加380 μL样本处理液的处理管中;(2)马上盖好样本处理管的盖子,然后上下颠倒 8~10次;(3)当样本处理管中混合溶液变为棕色后即说明血液已经处理完成。

     4. 操作 (1)芯片传感-微分电位溶出法:血样处理好后应在5 min内测试;取出传感器并核对传感器校正码一致,将传感器从黑色条纹处完全插入到仪器中,从样本处理管中吸液至加样刻度处,将样本滴加在传感器加样孔内完全覆盖,确认传感器上已经加入血样后,按下"启动"键,仪器自动检测并在2 min内显示结果;(2) 氢化物发生原子荧光法:严格按仪器操作规程执行。

三、方法学评价

    1.正确度实验 用芯片传感-微分电位溶出法分别对6种标准物质(血铅标准物质为2011年全国血铅检测室间质评用血)进行测定来评价此方法测定的准确性,每种标准物质平行测定4次,取其均值与给定靶值比较。

    2.重复性试验 选取低、中、高3个水平的样本,采用芯片传感--微分电位溶出法测定血铅含量,每个样本重复测定18次,计算均值±标准差和相对标准偏差(RSD)。

    3. 回收实验 随机选取6个样本,在475 μL血样中分别加入1 000μg/L标准铅溶液[标准溶液为国家标准物质GBW(E)080129] 25、50和100μL,使之加标量分别为50、100和200 μg/L。采用芯片传感-微分电位溶出法测定加标前及加标后的血铅含量。每份样本重复测定4次,计算均值。

    4. 比对试验 将2011年5月~6月到医院就诊检测血铅的成人与儿童血样按氢化物发生原子荧光法测定结果分为高、中、低浓度3组,然后从这3组中随机抽取58份样本,同时采用芯片传感-微分电位溶出法和氢化物发生原子荧光法检测。

四、统计学方法

    采用SPSS13.0统计软件分析血铅检测结果,采用配对t检验分析2种方法间差异,P<0.05表示差异有统计学意义。

结  果

一、正确度实验

    以靶值±10%作为允许误差,6种标准物质的测定结果与靶值比较,均在允许误差范围之内,说明仪器的正确度良好。见表1。

表1 标准物质的测定结果(μg/L)

标准物质编号

微分电位溶出法

结果均值

靶值

1

2

3

4

5

6

60.3

127.4

228.9

231.1

301.0

175.7

61.5

130.0

225.0

237.0

319.0

182.0

二、重复性试验

    根据血铅临床检验技术规范规定:血铅检测方法的相对标准偏差(RSD)应根据测定浓度范围的不同而分别为20~100 μg/L时RSD≤15%;>100 μg/L时 RSD≤10%。低、中、高3个水平样本的相对标准偏差(RSD)分别为6.98%、4.09%、2.78%,见表2。本法相对标准偏差较小,重复性好,精密度佳。

表2 重复性实验结果

样本编号

血铅(μg/L)

RSD(%)

1

2

3

51.69±3.61

101.14±4.14

160.26±4.45

6.98

4.09

2.78

三、回收实验  

    样本的平均回收率为98.1%,系统比例误差为1.9%。CLIA’88中对血铅检测的固定限目标为19.3%,系统比例误差在固定限目标要求范围之内,同时也说明方法的线性失拟误差(LoF)是符合要求的。见表3。

表3 不同加标量的回收试验结果

样本编号

加标量

(μg/L)

试样测定值(μg/L)

加标试样测定值(μg/L)

加标回收率(%)

1

2

3

4

5

6

50

50

100

100

200

200

49.4

61.2

55.5

54.8

79.5

57.9

94.2

121.3

152.4

148.7

263.8

249.8

89.6

120.2

97.0

93.9

92.2

95.9

   

四、比对试验

    1. 芯片传感-微分电位溶出法与氢化物原子荧光法血铅测定结果比较  芯片传感-微分电位溶出法的可报告范围为20~650 μg/L,58份样本均在此范围内。结果见图1和表4。

表4  2种方法的临床样本测定结果

样本号

SC-DPSA

(µg/L)

HGAFS

(µg/L)

样本号

SC-DPSA

(µg/L)

HGAFS

(µg/L)

样本号

SC-DPSA

(µg/L)

HGAFS

(µg/L)

1

66.6

68.6

21

433

416

41

66

32

2

70.9

73.3

22

212

224

42

29

27

3

77.7

78.1

23

309

332

43

320

300

4

67.5

70.2

24

116

112

44

20

29

5

73.2

70.7

25

77

99

45

21

30

6

43

35

26

39

27

46

25

38

7

37

43

27

22

33

47

43

32

8

43

40

28

311

240

48

31

30

9

52

42

29

71

61

49

20

38

10

38

30

30

25

28

50

61

28

11

82

75

31

49

30

51

39

37

12

108

112

32

64

44

52

69

28

13

40

35

33

62

32

53

20

27

14

52

42

34

277

250

54

18

26

15

55

62

35

23

32

55

411

451

16

49

52

36

39

55

56

75

84

17

42

38

37

44

60

57

188

158

18

167

178

38

26

30

58

142

105

19

152

144

39

12

26

 

 

 

20

138

151

40

52

28

 

 

 

 

注:Y=0.992 7X+4.368 8,R2=0.963 6

图1 2种方法的临床样本测定结果比较

    2. 差异性分析 采用配对样本的t检验对数据进行分析,结果差异无统计学意义(t=-0.21,P=0.867),线性回归分析相关系数(R2)=0.964,2种方法测定结果的符合度为96.4%。

讨论

    铅在自然界中广泛存在,易通过消化道、呼吸道被人体吸收。铅可长期蓄积于人体,严重危害神经系统、消化系统和造血系统,对儿童的智力和身体发育影响尤其严重;对成人来说,血铅浓度升高会对心血管、中枢神经、生殖、血液循环等系统造成不良影响。进入血液中的铅大部分与红细胞膜结合,经血循环被组织吸收后转移到骨骼,产生蓄积作用。由于血铅含量较稳定,波动小,故血铅成为反映近期铅接触较为灵敏的指标,测定全血铅对铅中毒的诊断、防治工作具有重要意义。

    长期以来,常用的全血铅分析方法有:微分电位溶出分析法(DPSA)、石墨炉原子吸收光谱法、氢化物发生原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法。而这些方法大多需要特殊仪器及相对复杂的操作程序和技术难度。相比较而言,DPSA实用,但因基体干扰等问题,重现性不够好[8]。而且,电极在含有大量有机杂质的底液中反复使用,汞膜容易因摩擦而不断脱落变薄,寿命极短[9]。芯片传感-微分电位溶出法使用一次性丝印芯片传感器,能确保结果的稳定性。同时,在样本处理和测试操作上更加简单和方便,从采样到报告结果需时不超过10 min。

    本研究结果显示芯片传感--微分电位溶出法测定血铅,操作简便、快速,且准确度高,重复性好,精密度佳;与氢化物发生原子荧光法检测结果比较差异无统计学意义(P>0.05),适合各种机构开展应用。

参考文献

[1]Carrington CD,Sheehan DM.Bolger PM.Hazard assessment of lead[J].Food Addit Contam, 1993, 10(3):325-335.

[2]戚其平,杨艳伟,姚孝元,等. 中国城市儿童血铅水平调查[J]. 中华流行病学杂志,2002,23(3):162-166.

[3]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].第3版.南京:东南大学出版社,2006:397-405.

[4]郭 锐,郑妹凤. 血铅含量的微分电位法和石墨炉原子吸收法的分析比较[J]. 安徽预防医学杂志,2011, 17(4): 324,封3.

[5]肖义森. 全血微量血铅检测微分电位溶出法的建立与评价[J]. 国际检验医学杂志,2011,32(12):1291-1292.

[6] Jothimuthu PWilson RAHerren J,et al. Lab-on-a-chip sensor for detection of highly electronegative heavy metals by anodic stripping voltammetry[J]. Biomed Microdevices,2011,13(4):695-703.

[7] Jang AZou ZMacKnight E,et al. Development of a portable analyzer with polymer lab-on-a-chip (LOC) for continuous sampling and monitoring of Pb(II)[J]. Water Sci Technol,2009,60(11): 2889-2896.

[9]王文军,刘 琥,隋桂英,等.微分电位溶出法检测微量全血中铅含量的方法研究[J].济宁医学院学报,2005,28(3):63-64.

[10]王 伟,黄福模,吴小平,等.消化血铅的微分电位溶出分析法[J].中国职业医学,2002, 29(6):39-40.  

 

 

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    新型芯片传感-微分电位溶出法测定血铅的探讨

    辛君伟1,2  盛青松1,2

    (1.无锡市申瑞生物制品有限公司,江苏无锡,214092;

      2.江苏省丝网印刷电极式生物传感器工程技术研究中心,江苏无锡,214092)

    摘要:

         评价芯片传感-微分电位溶出法在临床血铅检测的准确度和重复性,并与氢化物发生原子荧光法比较,为临床选择检测方法提供参考依据。分别运用芯片传感-微分电位溶出法和氢化物发生原子荧光法同时检测血液样本和标准物质(为2011年全国血铅检测室间质评用血),评价芯片传感-微分电位溶出法的正确度、重复性、回收率、可报告范围和符合率。以靶值±10%作为允许误差,6种标准物质的芯片传感-微分电位溶出法测定结果与靶值比较,均在允许误差范围之内,正确度良好;低、中、高3个水平样本的相对标准偏差(RSD)分别为6.98%、4.09%、2.78%;平均回收率为98.1%,系统比例误差为1.9%;与氢化物发生原子荧光法比较,结果差异无统计学意义(P>0.05),线性回归分析相关系数(R2)=0.964,2种方法测定结果的符合度为96.4%。 芯片传感-微分电位溶出法准确度高,重复性好,精密度佳,是一种适用于临床血铅检测的快捷、准确、方便的方法。

    关键词:血铅;芯片传感器;微分电位溶出法;氢化物发生原子荧光光谱法

         铅是具神经毒性的重金属元素。铅在体内含量超过一定水平就会对健康引起难以恢复的损害。铅中毒已成为发展中国家儿童面临的突出环境问题[1-2]。血铅检测是了解人体铅污染的最佳途径。卫生部已于2006年明确规定临床测定血液中铅浓度的基本方法为石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)和微分电位溶出法(DPSA)。这两种方法虽然具备了良好的灵敏度,但是都需要较为复杂的样本前处理和较高的仪器要求[3-5]。

         近年来,无锡市申瑞生物制品有限公司在国内外最新研究进展[6-7]的基础上,通过建立合适的样本前处理方法并优化反应条件,将新型丝印传感器应用于微分电位溶出法(DPSA)检测,开发出了全新的血铅检测仪。我们对该仪器进行了方法学性能评价,并与氢化物发生原子荧光法进行比对。

    材料和方法

    一、仪器及试剂 

         1. 芯片传感-微分电位溶出法 SR-P-100血铅专用型微量元素检测仪及配套试剂,由无锡市申瑞生物制品有限公司提供。

        2. 氢化物发生原子荧光法 AF-610B原子荧光分析仪,由北京瑞利公司生产。

    二、方法

        1. 芯片传感-微分电位溶出法原理   该法利用微分电位溶出法(DPSA)和丝印传感器来测试血液中铅含量。人体血液中90%左右的铅在红细胞内。当血样和样本处理管中的处理液混合后,红细胞在强电解质的影响下破裂,具备电化学活性的铅裂解出来。当测试开始后,血样中的铅离子在一定的电位下,会富集在传感器上,这个过程是铅离子富集过程,也是微分电位溶出可以检测痕量铅的原因。撤除电位后,溶液中的氧化剂使镀在传感器上铅溶出到溶液中,记录下溶出过程中电位-时间曲线,找出电位变化和铅离子浓度关系后即可计算出样本中的铅离子浓度。

        2. 血液采集 成人采集静脉血,EDTA-K2抗凝;儿童采集末梢血,采用0.5%硝酸棉球→75%酒精棉球→干棉球处理采血部位后采集血液。

        3. 样本前处理 (1) 打开样本处理管的盖子,将20 μL末梢血或EDTA-K2抗凝血转移到已预加380 μL样本处理液的处理管中;(2)马上盖好样本处理管的盖子,然后上下颠倒 8~10次;(3)当样本处理管中混合溶液变为棕色后即说明血液已经处理完成。

         4. 操作 (1)芯片传感-微分电位溶出法:血样处理好后应在5 min内测试;取出传感器并核对传感器校正码一致,将传感器从黑色条纹处完全插入到仪器中,从样本处理管中吸液至加样刻度处,将样本滴加在传感器加样孔内完全覆盖,确认传感器上已经加入血样后,按下"启动"键,仪器自动检测并在2 min内显示结果;(2) 氢化物发生原子荧光法:严格按仪器操作规程执行。

    三、方法学评价

        1.正确度实验 用芯片传感-微分电位溶出法分别对6种标准物质(血铅标准物质为2011年全国血铅检测室间质评用血)进行测定来评价此方法测定的准确性,每种标准物质平行测定4次,取其均值与给定靶值比较。

        2.重复性试验 选取低、中、高3个水平的样本,采用芯片传感--微分电位溶出法测定血铅含量,每个样本重复测定18次,计算均值±标准差和相对标准偏差(RSD)。

        3. 回收实验 随机选取6个样本,在475 μL血样中分别加入1 000μg/L标准铅溶液[标准溶液为国家标准物质GBW(E)080129] 25、50和100μL,使之加标量分别为50、100和200 μg/L。采用芯片传感-微分电位溶出法测定加标前及加标后的血铅含量。每份样本重复测定4次,计算均值。

        4. 比对试验 将2011年5月~6月到医院就诊检测血铅的成人与儿童血样按氢化物发生原子荧光法测定结果分为高、中、低浓度3组,然后从这3组中随机抽取58份样本,同时采用芯片传感-微分电位溶出法和氢化物发生原子荧光法检测。

    四、统计学方法

        采用SPSS13.0统计软件分析血铅检测结果,采用配对t检验分析2种方法间差异,P<0.05表示差异有统计学意义。

    结  果

    一、正确度实验

        以靶值±10%作为允许误差,6种标准物质的测定结果与靶值比较,均在允许误差范围之内,说明仪器的正确度良好。见表1。

    表1 标准物质的测定结果(μg/L)

    标准物质编号

    微分电位溶出法

    结果均值

    靶值

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    60.3

    127.4

    228.9

    231.1

    301.0

    175.7

    61.5

    130.0

    225.0

    237.0

    319.0

    182.0

    二、重复性试验

        根据血铅临床检验技术规范规定:血铅检测方法的相对标准偏差(RSD)应根据测定浓度范围的不同而分别为20~100 μg/L时RSD≤15%;>100 μg/L时 RSD≤10%。低、中、高3个水平样本的相对标准偏差(RSD)分别为6.98%、4.09%、2.78%,见表2。本法相对标准偏差较小,重复性好,精密度佳。

    表2 重复性实验结果

    样本编号

    血铅(μg/L)

    RSD(%)

    1

    2

    3

    51.69±3.61

    101.14±4.14

    160.26±4.45

    6.98

    4.09

    2.78

    三、回收实验  

        样本的平均回收率为98.1%,系统比例误差为1.9%。CLIA’88中对血铅检测的固定限目标为19.3%,系统比例误差在固定限目标要求范围之内,同时也说明方法的线性失拟误差(LoF)是符合要求的。见表3。

    表3 不同加标量的回收试验结果

    样本编号

    加标量

    (μg/L)

    试样测定值(μg/L)

    加标试样测定值(μg/L)

    加标回收率(%)

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    50

    50

    100

    100

    200

    200

    49.4

    61.2

    55.5

    54.8

    79.5

    57.9

    94.2

    121.3

    152.4

    148.7

    263.8

    249.8

    89.6

    120.2

    97.0

    93.9

    92.2

    95.9

       

    四、比对试验

        1. 芯片传感-微分电位溶出法与氢化物原子荧光法血铅测定结果比较  芯片传感-微分电位溶出法的可报告范围为20~650 μg/L,58份样本均在此范围内。结果见图1和表4。

    表4  2种方法的临床样本测定结果

    样本号

    SC-DPSA

    (µg/L)

    HGAFS

    (µg/L)

    样本号

    SC-DPSA

    (µg/L)

    HGAFS

    (µg/L)

    样本号

    SC-DPSA

    (µg/L)

    HGAFS

    (µg/L)

    1

    66.6

    68.6

    21

    433

    416

    41

    66

    32

    2

    70.9

    73.3

    22

    212

    224

    42

    29

    27

    3

    77.7

    78.1

    23

    309

    332

    43

    320

    300

    4

    67.5

    70.2

    24

    116

    112

    44

    20

    29

    5

    73.2

    70.7

    25

    77

    99

    45

    21

    30

    6

    43

    35

    26

    39

    27

    46

    25

    38

    7

    37

    43

    27

    22

    33

    47

    43

    32

    8

    43

    40

    28

    311

    240

    48

    31

    30

    9

    52

    42

    29

    71

    61

    49

    20

    38

    10

    38

    30

    30

    25

    28

    50

    61

    28

    11

    82

    75

    31

    49

    30

    51

    39

    37

    12

    108

    112

    32

    64

    44

    52

    69

    28

    13

    40

    35

    33

    62

    32

    53

    20

    27

    14

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    42

    34

    277

    250

    54

    18

    26

    15

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    62

    35

    23

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    411

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    16

    49

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    36

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    55

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    17

    42

    38

    37

    44

    60

    57

    188

    158

    18

    167

    178

    38

    26

    30

    58

    142

    105

    19

    152

    144

    39

    12

    26

     

     

     

    20

    138

    151

    40

    52

    28

     

     

     

     

    注:Y=0.992 7X+4.368 8,R2=0.963 6

    图1 2种方法的临床样本测定结果比较

        2. 差异性分析 采用配对样本的t检验对数据进行分析,结果差异无统计学意义(t=-0.21,P=0.867),线性回归分析相关系数(R2)=0.964,2种方法测定结果的符合度为96.4%。

    讨论

        铅在自然界中广泛存在,易通过消化道、呼吸道被人体吸收。铅可长期蓄积于人体,严重危害神经系统、消化系统和造血系统,对儿童的智力和身体发育影响尤其严重;对成人来说,血铅浓度升高会对心血管、中枢神经、生殖、血液循环等系统造成不良影响。进入血液中的铅大部分与红细胞膜结合,经血循环被组织吸收后转移到骨骼,产生蓄积作用。由于血铅含量较稳定,波动小,故血铅成为反映近期铅接触较为灵敏的指标,测定全血铅对铅中毒的诊断、防治工作具有重要意义。

        长期以来,常用的全血铅分析方法有:微分电位溶出分析法(DPSA)、石墨炉原子吸收光谱法、氢化物发生原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法。而这些方法大多需要特殊仪器及相对复杂的操作程序和技术难度。相比较而言,DPSA实用,但因基体干扰等问题,重现性不够好[8]。而且,电极在含有大量有机杂质的底液中反复使用,汞膜容易因摩擦而不断脱落变薄,寿命极短[9]。芯片传感-微分电位溶出法使用一次性丝印芯片传感器,能确保结果的稳定性。同时,在样本处理和测试操作上更加简单和方便,从采样到报告结果需时不超过10 min。

        本研究结果显示芯片传感--微分电位溶出法测定血铅,操作简便、快速,且准确度高,重复性好,精密度佳;与氢化物发生原子荧光法检测结果比较差异无统计学意义(P>0.05),适合各种机构开展应用。

    参考文献

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