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【CAIVD蓝皮书】体外诊断产品相关原材料(四)

四、载体

1,免疫层析技术

快速诊断试纸条是20世纪90年代在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术,具有快速、简便、单人份检测、经济的优点(图1),现已广泛应用于医学检测、食品质量监测、环境监测、农业和畜牧业、出入境检验检疫、法医定案等领域。

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图4.9-11免疫层析试纸条

胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术以大孔径的微孔滤膜(NC膜,硝酸纤维素膜)为载体,将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上,当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后,通过毛细作用向前移动,与结合垫上的胶体金标记试剂发生特异的免疫反应,再移动到NC膜上,被固定在NC膜表面的抗原或抗体捕获,聚集在检测带上,通过目测硝酸纤维素表面标记物(胶体金或乳胶颗粒)的光反射信号的密度得到直观的显色结果。其它未结合的标记物则越过检测带,流入吸水垫中,达到自动分离的目的(图2)。

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图4.9-12 免疫层析试纸条的结构

2. 膜的挑选与关键性能指标

蛋白结合能力

对于侧向层析试纸条,硝酸纤维素高分子聚合物的表面积决定了有多少蛋白可以固定于NC膜上。NC膜的表面积主要由膜的孔径、成孔率(膜的单位体积内的空气百分比含量)、厚度以及多孔结构所决定。在其他参数都相同的条件下,膜的表面积与孔径呈非线性反比关系;与厚度成线性正比关系;与成孔率呈非线性正比关系。以孔径0.1um硝酸纤维素膜为例,它的表面积是孔径10um滤膜的10倍,而非100倍。由膜的多孔结构形成的总表面积通常用m2/g表示,膜的基重容易测量,用g/ m2表示,二者相乘即比表面积,可表示为:内部总表面积/膜的平面面积。对于孔径非常小的膜(如:0.1um滤膜),比表面积可达2000,而对用于侧向层析上的大孔径的膜,比表面积通常在50-200范围内。

NC膜与蛋白的结合能力主要由蛋白的斯托克斯半径及三维结构决定。以IgG为例,蛋白载量约为1μg/cm2,用蛋白载量(1μg/cm2)乘以层析膜的比表面积(50-200)可以估算出单位面积IgG与NC膜的结合量约为50-200μg/cm2。如果试纸条宽25px,T线宽度1mm,那么IgG的结合量约为5-20μg (0.1 cm 宽 x 1 cm 长 = 0.1 cm2)。由此可见,NC膜对于IgG的静态结合能力约为市场上大部分检测项目要求的10-100倍,NC膜对蛋白的结合能力完全可以满足IVD生产企业的要求。

硝酸纤维素膜主要通过静电吸附作用与蛋白结合(图3)。尽管硝酸纤维素属中性,其与蛋白的结合不受pH值的影响,但是pH值仍可通过影响蛋白在喷膜缓冲液中的稳定状态进而影响蛋白与膜的结合。喷膜时,诸如Tween 20 和Triton™ X-100等离液剂应尽量避免,或者控制其使用浓度在0.01% v/v以下。这些物质会干扰蛋白与膜的结合,如果喷膜缓冲液中加入此类物质,可能会出现样品流经T/C线时信号出现,随后固定在NC膜上的抗原或抗体从膜上洗脱下来,信号消失的现象。如果出于降低非特异性结合或反应背景的目的需要加入离液剂,通常建议加在样品垫中。

 

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图4.9-13 硝酸纤维素膜与蛋白的静电吸附作用

毛细流动速度

毛细流动速度通常指样品的液流前锋流经NC膜时的迁移速度。毛细流动速度比较难测量,随着样品迁移距离的加长,毛细流动速度开始逐渐变慢。为了便于衡量NC膜在侧向层析中的整体表现,NC膜的生产厂商引入了毛细流动时间的概念。毛细流动时间体现的是液体在NC膜上迁移一定距离(通常为100px)所用的时间。以默克HF135型号的膜为例,其含义是纯水在50 +/- 5% R.H. and 21 +/- 1.5°C条件下流过100px距离所用的时间是135秒。

NC膜的毛细流动速度对于侧向层析试纸条的性能至关重要。默克是全球第一家生产侧向层析膜的生产商,也是首家将毛细流动时间作为层析膜质量控制标准的公司。NC膜的毛细流动时间与试纸条的灵敏度关系如下(图4):

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图4.9-14 NC膜的毛细流动时间与试纸条的灵敏度关系

    试纸条上的免疫反应是一个动态体系,在判读结果的时候免疫反应并没有达到平衡。C/T线上的信号强度取决于各个组分在分子水平上足够接近,形成免疫复合物的有限时间。毛细流动速度决定了这一时间的长短。样本中待检物的有限浓度与毛细流动速度的平方呈反比(图5)。例如,当毛细流动速度由X增加到1.25X时,样本中待检物的有效浓度则降低了36% (1-(1/1.252))。

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图4.9-15:毛细流动速度与试纸条灵敏度的关系

此外,我们也可以用抗原抗体免疫复合物结合公式来理解这一概念。R表示在C/T线形成的抗原抗体复合物的总量,R等于K(抗原抗体的亲和系数)乘以抗原和抗体的浓度,当流速为1X时,R = k[Ab][Ag]。假设流速由1X增加到2X,那么抗原与抗体在分子水平上足够接近形成免疫复合物的时间就缩短了一半,尽管抗原抗体的实际浓度没有任何改变,但是他们的有效浓度均降低到原来的一半,用公式表示为:R = k[0.5 x Ab][0.5 x Ag] = 0.25 k[Ab][Ag],相当于样本中的待检物浓度降低到原来的四分之一。因此,如果我们将流速为180秒/100px(如HF180)的膜换成流速为90秒/100px(如HF090)的膜,产品的灵敏度会降低4倍。在某些产品上,即便通过增加捕获抗体或检测抗体的浓度也难以弥补由于膜的流速加快而导致的灵敏度的降低。而且,通过增加抗体的使用量来提高产品灵敏度,会带来产品成本上升,特异性下降等问题。

另一个需要考虑的因素是样品在NC膜上的迁移速度会随距离的加长而以指数方式降低。例如,样品由X cm迁移到2X cm所用时间是从起点到X cm距离的2倍;也就是说如果样品用1分钟的时间从起点迁移到25px距离,那么迁移到下一个25px所用的时间通常要2分钟以上。因此,T线距离起点的位置对于层析试纸条的灵敏度有很大影响。T线的位置距离原点越远,样品到达T线位置时的速度越慢,样品的有效浓度就越高,灵明度也相应越高。

既然样品经过C/T线时的速度决定了其有效浓度,由于C线与T线不在同一位置,因此样品中的待检物与C线和T线的结合动力学也不尽相同。对于多重检测项目(在同一试纸条上检测两种以上的待检物)亦是如此。距离原点最近的T线由于样品流速快,因此需要使用更多的捕获抗体或检测抗体。在设计产品的时出于成本考虑可以将抗原抗体亲和系数较高的检测项目放在最前面。

毛细流动速度除影响产品灵敏度外,也会在一定程度上改变C/T线的形态。C/T线在流速快的膜上线条较粗,在流速慢的膜上线条则较细。使用流速快的膜(如HF75)在检测弱阳的样本时可能会带来一些问题,影响产品的最低检出限度。

厚度

膜的厚度对于层析试纸条的影响主要有以下几个方面,分别是:床体积、C/T线宽度、拉伸强度及C/T线信号的可视性。

床体积

如果试纸条不使用吸水垫,NC膜的床体积将决定可供检测的样品量,膜越厚,床体积也越大。对于25px X 125px,厚度为130μm的膜,其体积为0.065 cm3(长X宽X厚度),如果膜的成孔率为70%,那么它的床体积应为:45.5 μL (0.7 x 65 μL)。如果NC膜的厚度由130μm变为110μm,那么其床体积将减少为38.5 μL;相反,如果NC膜的厚度变为130μm,其床体积将增加到52.5 μL。因此,如果没有吸水垫,NC膜厚度的改变将显著影响可供检测的样品量。当然,如果试纸条使用吸水垫,则待检的样品量主要由吸水垫的床体积决定。

C/T线宽度

膜的厚度也会影响C/T线的宽度。如果喷膜的体积一定,则越薄的膜,C/T线越宽,越厚的膜C/T线越窄。由于抗原或抗体的使用量没有改变,因此,越薄的膜,侧向扩散距离越远,在C/T线上产生的信号强度也会越低,进而影响试纸条的灵敏度。

拉伸强度

拉伸强度指在多大的力作用下可以将膜拉断,通常NC膜的孔径越大,厚度越薄则越容易拉断。用于层析的NC膜属于大孔径的膜,因此,如果没有背衬,此类膜较其它材质的膜更容易损坏。侧向层析膜的拉伸强度通常介于1.75到8.8牛顿/cm之间。带有背衬的NC膜很好的克服了这一缺点,与不带背衬的NC膜相比更易操作,降低了用户的生产损耗率。

C/T线信号的可视性

厚的膜能够吸收更多的样品,增加了到达C/T线的样品总量,因此,灵敏度也应该更高。但是这一优势被NC膜的固有性质所抵消。由于NC膜的光学特点,人的肉眼只能观测到膜表面10μm以内的区域(图6),用公式表示如下:%肉眼观测信号=可见深度(10μm)/膜的厚度。越厚的膜,肉眼可见信号的百分比也越低。这足以抵消掉由于床体积增加带来的灵敏度的提升。

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图4.9-16:C/T线侧面图示

表面活性剂

NC主要由硝酸纤维素的高分子聚合物组成,硝酸纤维素是疏水的,为了使膜能够润湿,需要在NC膜的生产过程中加入表面活性剂,表面活性剂对层析膜的性能影响主要表现在以下几个方面(图7):

影响毛细流动速度

为了使膜能够润湿,通常需要加入一定浓度的表面活性剂。如果在此基础上继续提高表面活性剂的浓度,液体侧向流动的均一性会有所改善,但是膜的润湿性能几乎不会有任何变化。通常,表面活性剂的种类及使用浓度对于特定的NC膜生产商来说是相对固定的。

影响蛋白吸附

表面活性剂无论从NC膜还是喷膜缓冲液的角度讲都会对蛋白吸附造成影响。如果NC的表面活性剂浓度过高,会妨碍蛋白与NC膜的结合。喷膜缓冲液中的表面活性剂浓度对蛋白结合影响更大。以生产上常用的Tween R 20、Triton™ X-100、PVA、PVP、PEG等表面活性剂为例,其主要通过与NC膜或者抗原/抗体结合来降低蛋白与膜的结合能力,特别是当表面活性剂的使用浓度高于CMC(临界胶束浓度)浓度时尤为如此。如果表面活性剂作为封闭剂的组成成分必须添加到系统中,通常建议使用的浓度越低越好,以防止表面活性剂将固定到膜上的抗原或抗体置换下来。表面活性剂推荐浓度如下:Tween R /Triton™ X-100 20为0.05% v/v;PVA, PVP和PEG为< 0.5% w/v。

对于喷膜过程及线条宽度的影响

喷膜过程的均一性受到NC膜润湿性能的影响。提高表面活性剂的使用浓度可以改善液体侧向流动的均一性,进而改善C/T线的线条宽度。然而,如果表面活性剂浓度过高,喷膜时的水线也会变宽。需要特别指出的是,水线与抗原/抗体结合到膜上形成的C/T蛋白线是两个概念,在绝大多数情况下,抗原/抗体分子与NC膜高分子聚合物的结合是瞬时发生的,只有喷膜缓冲液中的化学试剂组分或者被化学封闭的蛋白才会在液体的毛细作用下向C/T线条的上下两个方向侧向迁移。我们在喷膜过程中看到的水线往往比C/T蛋白线要宽一些,水线的宽窄无法准确预测蛋白线条的质量。

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图4.9-17 表面活性剂对于侧向层析膜的影响

NC膜的储存条件

NC膜保存时应避免与易挥发的有机溶剂接触,有机溶剂可与NC膜结合使膜变得疏水而无法使用。我们推荐的长期储存条件为10-25℃, 30-70% RH(相对湿度),产品应放置于阴凉、干燥、通风的环境,避免阳光直射造成局部过热。

免疫层析技术热点与新方向

随着免疫层析技术的飞速发展,定量、高灵敏度、多元检测、层析系统集成化,开始成为该领域新的研究方向,彩色微球、荧光微球以及磁珠已经成为继胶体金之后的新一代抗原/抗体标记物。与传统的胶体金相比,乳胶微球及磁珠具有良好的稳定性,线性范围宽,灵敏度高,非常适用于定量免疫层析检测中。

根据免疫层析试纸条所选标记物直径的不同,NC膜的适应性也有所不同。如果选择直径较大的乳胶颗粒(300-400nm),则只能选择孔径稍大,流速在HF135以下的NC膜,不同粒径的标记物在NC膜上的流动情况如下(图8):

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图4.9-18不同粒径的标记物在Hi-Flow PlusTM 系列硝酸纤维素膜上的流动情况

以目前市场上应用最为广泛的荧光微球(图9)为例,制作微球最为常用的材质为聚苯乙烯(PS)材料,荧光染料先通过膨胀的方法镶嵌在微球孔隙中,再使微球收缩,用物理的方法将染料不可逆地包埋在微球内部。对于无任何功能基团修饰的微球,抗原或抗体通过被动吸附作用固定在微球表面。对于有功能基团修饰的微球,抗原/抗体可通过共价交联的方式固定在微球表面。抗原/抗体的共价交联方法主要有两种,一种是两步法,交联前微球需先进行NHS/EDC活化,如-COOH羧基修饰的微球多采用此种方法;另一种是一步法,微球交联前只需更换缓冲液的pH值即可活化,操作方便,如新一代的-Tosyl、-CH2Cl修饰的微球就属此类。在产品开发初期,建议挑选三种不同粒径的微球(如最为常用的100nm、300nm、500nm等)同时进行评估,以确定最佳微球尺寸。随后对于选定的微球可以再选取不同浓度的功能基团(可分为高、中、低三档)以确定最佳的功能基团浓度。挑选微球过程中应关注以下几个方面:

l 微球荧光强度高、均一性好,在效期内稳定性好。

l 供应商能够提供多种粒径供选择(50nm-500nm)

l 功能基团选择灵活,如COOH、NH2、CH2Cl等,

l 有多重荧光供选择以满足不同激发光源需求(如U、X、XC、Y、Z等)

l 客户批次验证合格后,供应商可依客户需求为客户保留相应批次。

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图4.9-19 Estapor® 荧光微球


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    【CAIVD蓝皮书】体外诊断产品相关原材料(四)

    四、载体

    1,免疫层析技术

    快速诊断试纸条是20世纪90年代在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术,具有快速、简便、单人份检测、经济的优点(图1),现已广泛应用于医学检测、食品质量监测、环境监测、农业和畜牧业、出入境检验检疫、法医定案等领域。

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    图4.9-11免疫层析试纸条

    胶体金免疫层析技术

    胶体金免疫层析技术以大孔径的微孔滤膜(NC膜,硝酸纤维素膜)为载体,将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上,当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后,通过毛细作用向前移动,与结合垫上的胶体金标记试剂发生特异的免疫反应,再移动到NC膜上,被固定在NC膜表面的抗原或抗体捕获,聚集在检测带上,通过目测硝酸纤维素表面标记物(胶体金或乳胶颗粒)的光反射信号的密度得到直观的显色结果。其它未结合的标记物则越过检测带,流入吸水垫中,达到自动分离的目的(图2)。

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    图4.9-12 免疫层析试纸条的结构

    2. 膜的挑选与关键性能指标

    蛋白结合能力

    对于侧向层析试纸条,硝酸纤维素高分子聚合物的表面积决定了有多少蛋白可以固定于NC膜上。NC膜的表面积主要由膜的孔径、成孔率(膜的单位体积内的空气百分比含量)、厚度以及多孔结构所决定。在其他参数都相同的条件下,膜的表面积与孔径呈非线性反比关系;与厚度成线性正比关系;与成孔率呈非线性正比关系。以孔径0.1um硝酸纤维素膜为例,它的表面积是孔径10um滤膜的10倍,而非100倍。由膜的多孔结构形成的总表面积通常用m2/g表示,膜的基重容易测量,用g/ m2表示,二者相乘即比表面积,可表示为:内部总表面积/膜的平面面积。对于孔径非常小的膜(如:0.1um滤膜),比表面积可达2000,而对用于侧向层析上的大孔径的膜,比表面积通常在50-200范围内。

    NC膜与蛋白的结合能力主要由蛋白的斯托克斯半径及三维结构决定。以IgG为例,蛋白载量约为1μg/cm2,用蛋白载量(1μg/cm2)乘以层析膜的比表面积(50-200)可以估算出单位面积IgG与NC膜的结合量约为50-200μg/cm2。如果试纸条宽25px,T线宽度1mm,那么IgG的结合量约为5-20μg (0.1 cm 宽 x 1 cm 长 = 0.1 cm2)。由此可见,NC膜对于IgG的静态结合能力约为市场上大部分检测项目要求的10-100倍,NC膜对蛋白的结合能力完全可以满足IVD生产企业的要求。

    硝酸纤维素膜主要通过静电吸附作用与蛋白结合(图3)。尽管硝酸纤维素属中性,其与蛋白的结合不受pH值的影响,但是pH值仍可通过影响蛋白在喷膜缓冲液中的稳定状态进而影响蛋白与膜的结合。喷膜时,诸如Tween 20 和Triton™ X-100等离液剂应尽量避免,或者控制其使用浓度在0.01% v/v以下。这些物质会干扰蛋白与膜的结合,如果喷膜缓冲液中加入此类物质,可能会出现样品流经T/C线时信号出现,随后固定在NC膜上的抗原或抗体从膜上洗脱下来,信号消失的现象。如果出于降低非特异性结合或反应背景的目的需要加入离液剂,通常建议加在样品垫中。

     

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    图4.9-13 硝酸纤维素膜与蛋白的静电吸附作用

    毛细流动速度

    毛细流动速度通常指样品的液流前锋流经NC膜时的迁移速度。毛细流动速度比较难测量,随着样品迁移距离的加长,毛细流动速度开始逐渐变慢。为了便于衡量NC膜在侧向层析中的整体表现,NC膜的生产厂商引入了毛细流动时间的概念。毛细流动时间体现的是液体在NC膜上迁移一定距离(通常为100px)所用的时间。以默克HF135型号的膜为例,其含义是纯水在50 +/- 5% R.H. and 21 +/- 1.5°C条件下流过100px距离所用的时间是135秒。

    NC膜的毛细流动速度对于侧向层析试纸条的性能至关重要。默克是全球第一家生产侧向层析膜的生产商,也是首家将毛细流动时间作为层析膜质量控制标准的公司。NC膜的毛细流动时间与试纸条的灵敏度关系如下(图4):

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    图4.9-14 NC膜的毛细流动时间与试纸条的灵敏度关系

        试纸条上的免疫反应是一个动态体系,在判读结果的时候免疫反应并没有达到平衡。C/T线上的信号强度取决于各个组分在分子水平上足够接近,形成免疫复合物的有限时间。毛细流动速度决定了这一时间的长短。样本中待检物的有限浓度与毛细流动速度的平方呈反比(图5)。例如,当毛细流动速度由X增加到1.25X时,样本中待检物的有效浓度则降低了36% (1-(1/1.252))。

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    图4.9-15:毛细流动速度与试纸条灵敏度的关系

    此外,我们也可以用抗原抗体免疫复合物结合公式来理解这一概念。R表示在C/T线形成的抗原抗体复合物的总量,R等于K(抗原抗体的亲和系数)乘以抗原和抗体的浓度,当流速为1X时,R = k[Ab][Ag]。假设流速由1X增加到2X,那么抗原与抗体在分子水平上足够接近形成免疫复合物的时间就缩短了一半,尽管抗原抗体的实际浓度没有任何改变,但是他们的有效浓度均降低到原来的一半,用公式表示为:R = k[0.5 x Ab][0.5 x Ag] = 0.25 k[Ab][Ag],相当于样本中的待检物浓度降低到原来的四分之一。因此,如果我们将流速为180秒/100px(如HF180)的膜换成流速为90秒/100px(如HF090)的膜,产品的灵敏度会降低4倍。在某些产品上,即便通过增加捕获抗体或检测抗体的浓度也难以弥补由于膜的流速加快而导致的灵敏度的降低。而且,通过增加抗体的使用量来提高产品灵敏度,会带来产品成本上升,特异性下降等问题。

    另一个需要考虑的因素是样品在NC膜上的迁移速度会随距离的加长而以指数方式降低。例如,样品由X cm迁移到2X cm所用时间是从起点到X cm距离的2倍;也就是说如果样品用1分钟的时间从起点迁移到25px距离,那么迁移到下一个25px所用的时间通常要2分钟以上。因此,T线距离起点的位置对于层析试纸条的灵敏度有很大影响。T线的位置距离原点越远,样品到达T线位置时的速度越慢,样品的有效浓度就越高,灵明度也相应越高。

    既然样品经过C/T线时的速度决定了其有效浓度,由于C线与T线不在同一位置,因此样品中的待检物与C线和T线的结合动力学也不尽相同。对于多重检测项目(在同一试纸条上检测两种以上的待检物)亦是如此。距离原点最近的T线由于样品流速快,因此需要使用更多的捕获抗体或检测抗体。在设计产品的时出于成本考虑可以将抗原抗体亲和系数较高的检测项目放在最前面。

    毛细流动速度除影响产品灵敏度外,也会在一定程度上改变C/T线的形态。C/T线在流速快的膜上线条较粗,在流速慢的膜上线条则较细。使用流速快的膜(如HF75)在检测弱阳的样本时可能会带来一些问题,影响产品的最低检出限度。

    厚度

    膜的厚度对于层析试纸条的影响主要有以下几个方面,分别是:床体积、C/T线宽度、拉伸强度及C/T线信号的可视性。

    床体积

    如果试纸条不使用吸水垫,NC膜的床体积将决定可供检测的样品量,膜越厚,床体积也越大。对于25px X 125px,厚度为130μm的膜,其体积为0.065 cm3(长X宽X厚度),如果膜的成孔率为70%,那么它的床体积应为:45.5 μL (0.7 x 65 μL)。如果NC膜的厚度由130μm变为110μm,那么其床体积将减少为38.5 μL;相反,如果NC膜的厚度变为130μm,其床体积将增加到52.5 μL。因此,如果没有吸水垫,NC膜厚度的改变将显著影响可供检测的样品量。当然,如果试纸条使用吸水垫,则待检的样品量主要由吸水垫的床体积决定。

    C/T线宽度

    膜的厚度也会影响C/T线的宽度。如果喷膜的体积一定,则越薄的膜,C/T线越宽,越厚的膜C/T线越窄。由于抗原或抗体的使用量没有改变,因此,越薄的膜,侧向扩散距离越远,在C/T线上产生的信号强度也会越低,进而影响试纸条的灵敏度。

    拉伸强度

    拉伸强度指在多大的力作用下可以将膜拉断,通常NC膜的孔径越大,厚度越薄则越容易拉断。用于层析的NC膜属于大孔径的膜,因此,如果没有背衬,此类膜较其它材质的膜更容易损坏。侧向层析膜的拉伸强度通常介于1.75到8.8牛顿/cm之间。带有背衬的NC膜很好的克服了这一缺点,与不带背衬的NC膜相比更易操作,降低了用户的生产损耗率。

    C/T线信号的可视性

    厚的膜能够吸收更多的样品,增加了到达C/T线的样品总量,因此,灵敏度也应该更高。但是这一优势被NC膜的固有性质所抵消。由于NC膜的光学特点,人的肉眼只能观测到膜表面10μm以内的区域(图6),用公式表示如下:%肉眼观测信号=可见深度(10μm)/膜的厚度。越厚的膜,肉眼可见信号的百分比也越低。这足以抵消掉由于床体积增加带来的灵敏度的提升。

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    图4.9-16:C/T线侧面图示

    表面活性剂

    NC主要由硝酸纤维素的高分子聚合物组成,硝酸纤维素是疏水的,为了使膜能够润湿,需要在NC膜的生产过程中加入表面活性剂,表面活性剂对层析膜的性能影响主要表现在以下几个方面(图7):

    影响毛细流动速度

    为了使膜能够润湿,通常需要加入一定浓度的表面活性剂。如果在此基础上继续提高表面活性剂的浓度,液体侧向流动的均一性会有所改善,但是膜的润湿性能几乎不会有任何变化。通常,表面活性剂的种类及使用浓度对于特定的NC膜生产商来说是相对固定的。

    影响蛋白吸附

    表面活性剂无论从NC膜还是喷膜缓冲液的角度讲都会对蛋白吸附造成影响。如果NC的表面活性剂浓度过高,会妨碍蛋白与NC膜的结合。喷膜缓冲液中的表面活性剂浓度对蛋白结合影响更大。以生产上常用的Tween R 20、Triton™ X-100、PVA、PVP、PEG等表面活性剂为例,其主要通过与NC膜或者抗原/抗体结合来降低蛋白与膜的结合能力,特别是当表面活性剂的使用浓度高于CMC(临界胶束浓度)浓度时尤为如此。如果表面活性剂作为封闭剂的组成成分必须添加到系统中,通常建议使用的浓度越低越好,以防止表面活性剂将固定到膜上的抗原或抗体置换下来。表面活性剂推荐浓度如下:Tween R /Triton™ X-100 20为0.05% v/v;PVA, PVP和PEG为< 0.5% w/v。

    对于喷膜过程及线条宽度的影响

    喷膜过程的均一性受到NC膜润湿性能的影响。提高表面活性剂的使用浓度可以改善液体侧向流动的均一性,进而改善C/T线的线条宽度。然而,如果表面活性剂浓度过高,喷膜时的水线也会变宽。需要特别指出的是,水线与抗原/抗体结合到膜上形成的C/T蛋白线是两个概念,在绝大多数情况下,抗原/抗体分子与NC膜高分子聚合物的结合是瞬时发生的,只有喷膜缓冲液中的化学试剂组分或者被化学封闭的蛋白才会在液体的毛细作用下向C/T线条的上下两个方向侧向迁移。我们在喷膜过程中看到的水线往往比C/T蛋白线要宽一些,水线的宽窄无法准确预测蛋白线条的质量。

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    图4.9-17 表面活性剂对于侧向层析膜的影响

    NC膜的储存条件

    NC膜保存时应避免与易挥发的有机溶剂接触,有机溶剂可与NC膜结合使膜变得疏水而无法使用。我们推荐的长期储存条件为10-25℃, 30-70% RH(相对湿度),产品应放置于阴凉、干燥、通风的环境,避免阳光直射造成局部过热。

    免疫层析技术热点与新方向

    随着免疫层析技术的飞速发展,定量、高灵敏度、多元检测、层析系统集成化,开始成为该领域新的研究方向,彩色微球、荧光微球以及磁珠已经成为继胶体金之后的新一代抗原/抗体标记物。与传统的胶体金相比,乳胶微球及磁珠具有良好的稳定性,线性范围宽,灵敏度高,非常适用于定量免疫层析检测中。

    根据免疫层析试纸条所选标记物直径的不同,NC膜的适应性也有所不同。如果选择直径较大的乳胶颗粒(300-400nm),则只能选择孔径稍大,流速在HF135以下的NC膜,不同粒径的标记物在NC膜上的流动情况如下(图8):

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    图4.9-18不同粒径的标记物在Hi-Flow PlusTM 系列硝酸纤维素膜上的流动情况

    以目前市场上应用最为广泛的荧光微球(图9)为例,制作微球最为常用的材质为聚苯乙烯(PS)材料,荧光染料先通过膨胀的方法镶嵌在微球孔隙中,再使微球收缩,用物理的方法将染料不可逆地包埋在微球内部。对于无任何功能基团修饰的微球,抗原或抗体通过被动吸附作用固定在微球表面。对于有功能基团修饰的微球,抗原/抗体可通过共价交联的方式固定在微球表面。抗原/抗体的共价交联方法主要有两种,一种是两步法,交联前微球需先进行NHS/EDC活化,如-COOH羧基修饰的微球多采用此种方法;另一种是一步法,微球交联前只需更换缓冲液的pH值即可活化,操作方便,如新一代的-Tosyl、-CH2Cl修饰的微球就属此类。在产品开发初期,建议挑选三种不同粒径的微球(如最为常用的100nm、300nm、500nm等)同时进行评估,以确定最佳微球尺寸。随后对于选定的微球可以再选取不同浓度的功能基团(可分为高、中、低三档)以确定最佳的功能基团浓度。挑选微球过程中应关注以下几个方面:

    l 微球荧光强度高、均一性好,在效期内稳定性好。

    l 供应商能够提供多种粒径供选择(50nm-500nm)

    l 功能基团选择灵活,如COOH、NH2、CH2Cl等,

    l 有多重荧光供选择以满足不同激发光源需求(如U、X、XC、Y、Z等)

    l 客户批次验证合格后,供应商可依客户需求为客户保留相应批次。

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    图4.9-19 Estapor® 荧光微球