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【CAIVD蓝皮书】血栓与止血诊断

编者按:

作者:

谢永华.png

谢永华

上海太阳生物技术有限公司总经理

《中国体外诊断产业发展蓝皮书》编委

中国医学装备协会检验医学分会血栓组副组长

2013-2015年度上海医疗器械行业领军人物


第一章血栓与止血诊断的发展历程及趋势


第一节概述


血栓与止血诊断是通过对各种因子的检测,从不同方面、不同环节了解其发病原因及病理过程,对血栓性疾病和出血性疾病的病因进行分析。近年来,随着血栓性疾病与出血性疾病在人类疾病谱中地位的变化,以及基础医学,临床医学和实验技术的发展,血栓与止血实验室检测出现了许多新的研究热点和发展趋势,并在全国逐步普及。


血栓与止血实验室检测的新技术和新方法不断涌现,用于血栓病和出血病的实验诊断项目日新月异,从筛选试验、确诊试验到分子生物学的基因检测、突变基因和异常蛋白的功能研究等,趋向更加简便、特异、系统和全面。


第二节发展历史


血栓与止血是一门新兴的边缘交叉学科,涉及基础医学、生物化学、免疫学、分子生物学以及临床医学研究领域。在20世纪上半叶,血液学家主要研究方向为出血及出血性疾病。随着研究的深入,发现血栓形成及其理论似乎较出血及出血性疾病更为重要,因为它在许多非血液疾病,尤其在严重危害人类健康和生命的一些疾病的发展中起重要作用。50年代取得了绝大多数血栓形成机制和血栓性疾病的实验室诊断技术的过程重要研究成果,于同时期提出了著名的内源性和外源性血液凝固通道理论,并将肝素和维生素K拮抗剂用于临床,其它口服抗凝剂也随后应用于静脉血栓和肺动脉血栓的治疗。到70年代,各种临床凝血测试方法的应用使大多数出血性疾病得以诊断和分类,对基础理论和临床实践的研究发展使血栓与止血形成了一门独立的学科,国际血栓与止血学会因此成立,进一步促进了学科的发展。80年代到90年代期间,分子生物学和人类基因组学、蛋白质生物化学、细胞生物学、分子药理学的迅猛发展带动了血栓与止血学科的深入研究与临床应用。许多出血性疾病和血栓性疾病的分子病理机制得到阐明,研制成功不少止血、抗凝和溶栓新药,并出现了许多新的诊断技术,在出血性疾病和血栓性疾病的治疗领域上取得了显著的进步。


第三节血栓与止血诊断技术发展与应用


随着血栓与止血的基础理论及其应用研究的日益深入和现代生物医学技术的进步,血栓与止血的检测技术和手段日趋先进和自动化,在临床血栓与止血疾病诊断中更加简便、快速、特异。现将血栓与止血诊断技术的发展现状和临床应用总结如下:


一、 血栓与止血检测技术

1、物理学方法

利用物理学原理构造的特殊仪器对血栓与止血相关的血液成分进行直接或间接检测的方法,通常有三大类:显微镜法、血液流变学法和流式细胞术。目前常用的方法包括手工进行的血清、血浆粘度玻璃管检测法;仪器对全血、血浆、血清黏度测定的锥板法、旋转法,仪器模拟血栓形成的体外血栓测定仪;手工及仪器进行的血小板和红细胞电泳等。流式细胞术则可方便进行血小板糖蛋白及其抗体的检测,以判断血小板功能改变对血栓与止血作用的影响。


其它还有以光电比浊为原理的血小板聚集仪和利用血小板在玻璃表面具粘附特性的血小板粘附测定仪。


2、生物学方法

生物学方法亦称凝固法,即将凝血因子激活剂加入待检血浆中,使血浆发生体外凝固。手工法,可凭肉眼观察到试管中出现纤维蛋白丝或血浆流动停止。凝血分析仪则可连续记录血浆凝固过程中的一系列变化如光、电及机械运动等,并将这些变化信号转变成数据,用计算机收集、处理数据后得出检测结果。这类方法发展最早,使用最广泛。目前,手工检测的凝固法主要有全血法、带部分凝血因子的缓冲液法和血浆法等,后者是现有手工法使用最多的一种检测方法;凝血分析仪使用的凝固法大致可分为三种:电流法、黏度法(亦称磁珠法)和光学法,后者是现有凝血分析仪使用最多的一种检测方法,其包括投射和散射比浊法。


3、生物化学法

生物化学方法主要是通过测定产色物质的吸光度变化,以推算待测物的含量。这类方法以酶学方法为基础,可直接定量,所需样品量小,测定结果准确、重复性好,便于标准化和自动化,可对止血与血栓过程中起作用的多种酶原活性进行检测,如凝血酶原、纤溶酶原、蛋白C、蛋白S及抗凝血酶等。手工的生物化学法是指人工配制各种缓冲液和工作液或以各种试剂盒中的试剂直接配成测定液在酶标仪上读出吸光度值,通过标准曲线来计算待测物的含量。凝血分析仪目前使用产色物质检测的指标大致可分为两种模式,即对酶原和酶抑制物进行测定,其特点是快速、稳定和节约试剂。


4、免疫学方法

以被检物作为抗原,制备相应的多克隆或单克隆抗体,利用抗原抗体的特异结合反应来对被检物进行定性和定量检测。其包括免疫扩散法、免疫比浊法、免疫电泳法、酶联免疫吸附试验和放射免疫测定等。


全自动凝血分析仪多采用免疫比浊法,其可通过透射或散射比浊分析来完成。此法的基本原理是当一定波长的光线通过反应混合液时,被其中抗原抗体反应形成的免疫复合物(IC)吸收而减弱。在一定范围内,透射光被吸收的量与IC量呈正相关,而IC的量则与相应抗原和抗体的量呈函数关系。


手工法应用更广泛,免疫扩散、免疫电泳、酶联免疫吸附试验和放射免疫测定在血浆止血与血栓相关蛋白检测中都使用。


5、干化学技术

干化学技术主要用于床旁凝血分析仪,其分析原理是将惰性顺磁铁氧化颗粒(PIOP)均匀分布并结合于可产生凝固或纤溶反应的干试剂中,PIOP可在一固定垂直磁场作用下移动。当血标本通过毛细管作用进入反应层后,可溶解干试剂,并发生相应的凝固和纤溶反应,同时与试剂结合的PIOP在反应过程中通过其移动或摆动幅度的大小改变而提供纤维蛋白形成或溶解的动力学特征,PIOP摆动所产生的光量变化可通过光电检测器记录,然后通过信号放大、转换、计算而得到检测结果。


6、分子生物学技术  

利用分子生物学技术对各种出血性、血栓性和血栓前状态疾病进行分子水平的检测和诊断。其中包括用于血友病、血管性血友病、易栓症等单基因病直接诊断的DNA测序、原位分子杂交技术;用于高凝状态、获得性血栓栓塞性疾病等多基因疾病间接诊断的PCR技术。


二、 血栓与止血检测的临床应用

1、血栓和止血检测在出血病诊断的应用

出血病由一期止血缺陷和二期止血缺陷导致,前者主要是指血管壁和血小板缺陷导致的出血,而后者主要是由凝血、抗凝缺陷所导致。


(1)一期止血缺陷

参与一期止血的有血管内皮细胞、血小板及纤维蛋白原等,其数量和质量异常均可导致出血。常用的筛选试验是出血时间和血小板计数。出血时间的延长可伴有血小板计数升高、正常或降低,均是出血病的实验室检查表现。血小板计数增多,部分患者患骨髓增殖性肿瘤;血小板计数减少,多见于免疫性血小板减少症(ITP),ITP的诊断目前多是排除性诊断,使用流式微球技术检测血小板上的自身抗体具有敏感性高、特异性强的特点。


随着技术的进步,作为一期止血的筛选试验,出血时间并未被淘汰,而是方法学上推荐使用模板法检测。国际上普遍使用PFA-100检测血小板功能、抗血小板药物的疗效和血管性血友病。


(2)二期止血缺陷

常用的筛选试验是凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)测定,该2 项检测是各级医院开展频率最高的凝血常规检测项目。根据两者同时检测的结果,可以大致对凝血因子缺陷症进行分类,进一步进行单个凝血因子的检测,可以对各类凝血因子缺陷性疾病做出诊断和鉴别诊断。


(3)纤维蛋白溶解系统异常导致的出血

纤维蛋白溶解系统组成复杂,作为该系统敏感的筛选试验,联合使用纤维蛋白(原)降解产物和D-二聚体可以完成。


2、血栓和止血检测在出血病治疗中的作用

缺乏因子的补充替代治疗往往是出血病尤其是凝血因子缺陷症治疗的主要手段。以往,出血病是手术的禁忌症,随着检测技术和生物医药产业的发展,禁区已经被打破,在输注一定剂量的血液制剂后,及时检测患者体内凝血因子的水平,若达到一定高度,就可以抵御手术出血的风险。围手术期定时检测凝血因子的水平并给予维持,可以保障患者围手术期的止血安全。


3、血栓和止血检测在血栓病诊断中的作用

血栓病临床上分为遗传性和获得性。体内主要抗凝蛋白如抗凝血酶、蛋白C、蛋白S的先天性缺乏,可以导致血栓性疾病。对静脉系统血栓病的检测可以发现部分患者具备这种先天性缺陷,但临床上大部分血栓病是各种获得性原因导致的,常用的血栓与止血检测可能无法检测出单一的致栓原因,但可从血管壁、血小板、凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统的检测中发现一个或几个方面的异常。目前,血栓弹力图可检测出患者体内的凝血功能和/或血小板功能抗进。


4、血栓和止血检测在血栓病治疗中的作用

肝素和相对分子质量肝素是最常见的肠外抗凝制剂,其作用主要依赖AT质和量的正常。因此,肝素/低相对分子质量肝素抗凝治疗实施以前,必须进行AT活性的检测,若AT活性低于70%,肝素治疗效果降低;AT活性低于50%,则肝素失效,检测中若发现这种情况后,要及时补充含AT制剂,国内的主要是血浆。以往,肝素治疗的监测指标是APTT,但该指标目前认为有较多局限性,因此,直接检测肝素的含量,对临床更有指导价值。目前,可以使用的抗血小板药物的监测手段有血管舒张剂刺激磷蛋白磷化程度、血栓弹力图和血小板聚集试验等。


5、血栓和止血在优生优育中的应用

由于先天性出血病和血栓病目前尚无法临床根治,且该类疾病具有遗传给后代的特点,如何通过实验室检测的手段进行优生优育干预,阻止患者的出生,是广大检验医学工作者的任务。以遗传性出血病为例,血友病A和B临床最为常见,且其为染色体伴性隐性遗传,由于男性仅有一条X染色体,一旦被累及即成为患者;女性有两条X染色体,一条被累及则为致病基因的携带者,可遗传给后代。血友病A的基因诊断可以从先证者着手,优先检测占血友病A重型患者的热点突变即FⅧ内含子22倒位和内含子1,若阳性则直接诊断;阴性情况下,可直接进行FⅧ外显子测序。目前,植入前基因诊断已经在国内起步,其整合了辅助生殖技术和基因诊断技术,采取从受精卵中获取个别卵裂球进行检测,将正常卵裂球植入母体子宫的策略,理论上可以彻底阻止单基因遗传疾病的发生,避免反复流产的风险,在遗传性出血病和血栓病的优生优育中有着极其广阔的应用前景。


第四节国内外血栓与止血诊断相关产品的主要生产企业


近年来,国家对体外诊断行业发展高度重视,血栓与止血研究得到飞速发展。在血栓与止血诊断行业,涌现出一批具有专业从事血栓与止血诊断产品研发、生产与销售的优秀企业,其产品具有较强竞争力,与进口的跨国公司产品争夺市场,打破进口产品的市场垄断局面,在市场份额中各占半壁江山。在血栓与止血诊断行业,主要企业情况如下:


一、  国外诊断产品主要生产企业

1、日本Sysmex 公司

日本Sysmex 公司是一家主要从事临床检验设备及试剂的开发、制造和销售的跨国企业,创建于1968年,原名为日本东亚医用电子株式会社。公司主要凝血分析系统系列产品包括:CS-2100i/2000i、CA-7000、CA-1500、CA-500系列等全自动和半自动凝血分析仪产品,主要与德国Siemens公司的凝血试剂配套使用,检测项目可包括:PT、APTT、FIB、TT;外源性因子(II,V,VII,X);内源性因子(VIII,IX,XI,XII);AT-III、FDP、D-二聚体、PLG、α2-AP、PC等。


2、法国STAGO公司

法国STAGO公司是一家成立于1945年,从药物分析起家,现成为体外诊断(IVD)行业中致力于血栓与止血研究的专业公司。目前血栓与止血诊断相关产品包括:STA-R、STA COMPACT、STA COMPACT CT、Start-4等全自动和半自动凝血分析仪,也同时提供配套的检测试剂,可用于血凝四项、外源性因子、内源性因子等测定。


3、美国Instrumentation Laboratory公司

美国IL公司总部设在美国马萨诸塞州,是一家为医院和临床试验室提供创新重症监护、血栓与止血诊断系统以及检测和数据解决方案的领先的生产企业。通过全球战略并购,目前在血栓与止血领域旗下已拥有ACL TOP ® 止血测试系统和HemosIL® 诊断试剂。


三、 国内诊断产品主要生产企业

1、上海太阳生物技术有限公司

上海太阳生物技术有限公司成立于2001年,专业从事血栓与止血诊断领域产品的研发、生产与销售的国家高新技术企业。专注于血栓与止血诊断试剂、全自动凝血分析仪及血凝杯、样品杯等系列产品,提供完整的血栓与止血诊断系统,是国内血栓与止血诊断行业的领军者。主要产品如下:


(1)体外诊断试剂

基于凝固法的试剂盒包括:凝血酶原时间(PT)测定试剂盒(冻干型/液体型)、凝血酶时间(TT)测定试剂盒(冻干型/液体型)、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒(冻干型白陶土/液体型白陶土)、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒(鞣花酸)、纤维蛋白原(FIB)含量测定试剂盒(冻干型/液体型)、蛋白S(PS)测定试剂盒、红斑狼疮抗凝物筛选(LAS)测定试剂盒、红斑狼疮抗凝物确诊(LAS)测定试剂盒;


基于胶乳免疫比浊法的试剂盒包括:D-二聚体(D-Dimer)测定试剂盒、纤维蛋白(原)降解产物(FDP)测定试剂盒;


基于发色底物法的试剂盒有抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)测定试剂盒、蛋白C(PC)测定试剂盒、肝素测定试剂盒、α2-抗纤溶酶(α2-AP)测定试剂盒;


基于乳胶凝集法的试剂盒包括:D-二聚体(D-Dimer)测定试剂盒、血浆纤维蛋白(原)降解产物(FDP)测定试剂盒;


其他包括:凝血质控品、D-二聚体质控品、纤维蛋白(原)降解产物(FDP)质控品、凝血分析用稀释液。


(2)全自动凝血分析仪

根据产品的不同测试速度和功能,其UP系列全自动凝血分析仪型号可分为UP1500、UP3000、UP5000、UP5500,集凝固法、发色底物法和免疫比浊法三位一体,由加样系统、恒温系统、测定系统、清洗系统和计算机系统组成,具有自动稀释、自动定标、自动存储、自动查询、自动筛选分析、自动条码扫描等功能。产品性能具有抗干扰能力强、检测灵敏度高、重复性好、软件界面直观友好等特点,最高测定速度达500测试/小时,可广泛应用于临床出血和血栓性疾病诊断,溶栓与抗凝治疗监测及疗效观察等,满足大中小不同规模医院的需求。


(3)医用耗材

包括与各种品牌国产和进口血凝仪厂家配套的血凝杯和样品杯,包括日本SYSMEX、美国IL、法国STAGO、德国BE、日本积水、北京普利生、北京赛科希德、深圳雷杜等。


2、 上海长岛生物技术有限公司

上海长岛生物技术有限公司主要从事凝血类诊断试剂研发、生产和销售的高科技型企业。2014年3月长岛生物被深圳迈瑞股权投资基金股份有限公司并购。目前,产品主要包括凝固法常规四项:凝血酶原时间(PT)试剂、活化部分凝血活酶(APTT)试剂、凝血酶时间(TT)试剂、纤维蛋白原(FIB)试剂(液体)。


3、 北京普利生仪器有限公司

北京普利生仪器有限公司主要从事医疗器械行业高新技术产品研发、生产和销售的现代化企业。主要产品系列包括:全自动和半自动检验类产品:全自动凝血分析仪/半自动血凝仪、全自动血液流变仪、半自动血液流变仪、全自动动态血沉测试仪。体外诊断试剂类产品包括:LBY血液流变仪质控物(含非牛顿和牛顿流体)、PT凝血酶原时间试剂盒、TT 凝血酶时间测定试剂盒、APTT活化部分凝血活酶时间测定试剂盒、FIB纤维蛋白原测定试剂盒。


4、 北京众驰伟业科技发展有限公司

北京众驰伟业科技发展有限公司是从事研发、生产、销售医疗检验仪器的高新技术企业。血栓与止血诊断相关产品主要为XL1000系列、XL3200系列、XL3600系列等凝血仪,可用于 APTT、PT、TT、FIB 、D-二聚体、FDP及凝血相关特殊项目,其配套试剂主要为进口试剂,其它还提供血流变仪、自动血沉压积测试仪、特种蛋白仪等。


5、 北京赛科希德科技发展有限公司

北京赛科希德科技发展有限公司致力于凝血、血流变、血沉及体外诊断试剂等产品的开发和生产,经过多年发展与沉淀,形成了集仪器、试剂、耗材于一体的产品体系。血栓与止血诊断相关产品主要为SF系列全自动凝血测试仪、SA系列全自动血流变测试仪、SD系列高速动态血沉压积测试仪、SC系列血小板聚集测试仪,并提供配套的试剂和耗材。


6、 天津美德太平洋科技有限公司

天津美德太平洋科技有限公司注册在天津市滨海高新区海泰绿色产业基地,是一家专业从事凝血仪器及配套试剂、特定蛋白仪器及配套试剂、葡萄糖/乳酸仪器及专用试剂耗材、细胞生物治疗全产业链产品的专业生产厂家。其血栓与止血相关产品包括RAC系列全自动凝血分析仪以及TS系列半自动血凝仪,可用于PT、APTT、TT和FIB等测定,并可提供配套的凝血试剂以及质控品。

 

第五节  血栓与止血诊断行业未来展望


目前,血栓与止血的诊断方法已由一般的筛选试验发展到全新的诊断试验;由手工发检测发展到自动化仪器检测;由观察试验的终点发展到观察试验的功能;由一个试验用一种方法检测发展到可采用多种方法检测;由单个基因突变分析发展到基因总体分析等。随着技术和医学科学的发展,血栓与止血实验检测的新技术和新方法不断涌现,为血栓病和出血病的实验诊断和基础研究提供了高效和准确的科学手段。未来血栓与止血诊断研究的热点和发展趋势大体概括为下:


1、 基因检测技术

基因突变是指基因组DNA分子在结构上碱基对的组成或排列顺序发生改变,即可导致个体表型的异常或疾病。目前常用的检测方法是:①点突变分析;②基因连锁分析;③mRNA分析;④DNA序列分析。随着基因治疗技术的不断发展与突破,这些新技术也将可能用于遗传性血栓与止血疾病的基因研究与基因治疗,如CRISPR/Cas9基因编辑技术、Ataluren(PCT124)、靶向药物研究等。


2、生物芯片技术      

生物芯片又称微阵列(microarray),是一种新型的基因功能分析技术。它主要是指通过缩微技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统,以实现对基因、蛋白质、细胞以及其他生物组分进行的准确、快速、大信息量的检测。目前生物芯片技术在某些遗传性出血性疾病(如血友病)、血小板疾病、凝血因子分子缺陷性疾病等方面得到广泛的应用。其原理是将一定数量的生物分子有序地固定在固相载体芯片上,加入相应的标记分子与生物分子结合或反应,利用相应的仪器对标志物进行分析。生物芯片在血栓与止血疾病的筛查和早期诊断上具有明显的优势,已经成为检验医学发展的热点之一。


3、质谱技术

质谱技术通常是用表面增强激光解析电离时间飞行质谱技术(ELDI-TOF-MS)与蛋白芯片有机结合,对复杂的生物分子混合物进行快速的质谱分析,其检测原理是利用激光脉冲辐射使被结合的蛋白质解析形成质荷电离子,不同质荷比的离子在真空场中飞行的时间长短不一,由此可绘制出质谱。SELDI-TOF-MS可用于直接选择性纯化和定量分析样品中的蛋白质或蛋自肽。若将其与正常人或某种疾病患者的质谱图或u基因库中的质谱作对照或比较,可发现特异性相关蛋白。已有人报道可用于对血栓性血小板减少性紫癜(TTP)进行快速实验诊断,随着SELDI-TOF-MS技术的发展和应用,其将在血栓与止血的实验诊断领域中发挥更大作用。


4、蛋白质组技术

二维电泳和质谱技术是蛋白质组学研究的重要手段,其主要用于血小板的基因组蛋白成分的研究。目前血小板蛋白质组技术已成为监测动脉血栓形成及抗血小板药物疗效的新方法。今后,蛋白质组学技术在血栓与止血的检测领域也会有更大的发展。

 

第二章 凝血分析仪


第一节 概述


血栓与止血是一门新兴的边缘学科,涉及基础医学、临床医学及预防医学的各个领域。利用凝血分析仪进行血栓与止血的实验室检查,为出血性和血栓性疾病的诊断与鉴别诊断、溶栓及抗凝治疗的监测与疗效观察提供有价值的指标。随着科学技术的日新月异,血栓与止血检测从传统的手工方法发展到全自动凝血分析仪,从单一的凝固法发展到免疫学和生物化学法,血栓与止血的检测变得简便、准确、精确。


第二节 发展历史


1910年Kottman发明了世界上最早的凝血分析仪,通过测定血液凝固时粘度的变化来反应凝固时间。1922年,Kugelmass用浊度计通过测定透射光的变化来反应血浆凝固时间。1950年,Schnitger和Gross发明了基于电流法的凝血分析仪。


20世纪60年代,机械法凝血分析仪得到开发。70年代以后,由于机械及电子工业的发展,各种类型的全自动凝血分析仪先后问世。80年代,发色底物的问世并应用于血液凝固的检测,使全自动凝血分析仪除可以进行一般的筛选试验外,还可以进行凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统单个因子的检测。80年代末,双磁路磁珠法的发明给血栓与止血的检测带来新概念,由于其独特的设计原理,使光学法检测的一些影响因素在本类型的检测仪器上均不复存在。90年代,全自动凝血分析仪免疫通道的开发又为血栓与止血的检测提供了一种新的手段。到目前为止,国内外凝血分析仪的发展主要经历了初期手工法、电流法、双磁路磁珠法、光学浊度法和光电磁珠法五个阶段。


光学法及磁珠法的灵敏度高、重复性好、易于自动化,从而使凝血分析仪的应用进入了一个崭新的发展时期。但早期采用光学法检测的凝血分析仪,遇黄疸、乳糜或浑浊等,会对对吸光度或散射光强度产生影响,会造成检测结果不准确。仪器开发制造商对光学法进行了改进,在光散射法的基础上配合了百分比(去本底)凝固时间测定原理,解决了高脂、黄疸和溶血对凝固时间的干扰,并可测出低纤维蛋白原样本的凝固时间。


第三节 应用现状


凝血分析仪按自动化程度可分为半自动化及全自动化,前者主要检测一般常规凝血项目,后者则有自动吸样、稀释样品、检测、结果储存、数据传输、结果打印、质量控制等功能,除对凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统功能进行全面的检测,尚能对抗凝、溶栓治疗进行实验室监测。


目前,国内使用的凝血分析仪主要为进口仪器。早期引进的凝血分析仪多是价格偏低、检测速度慢、测定项目较少的半自动仪器,且数量较少。随着国内经济发展水平的提高,近几年来引进的仪器数量大大增加,主要以全自动的中档仪器为主,主要有日本Sysmex的CA 系列、美国IL的ACL系列、德国的TECO 系列、德国的BE 系列以及法国的STAGO 系列等,这些凝血分析仪都具有自动化程度高、多通道化、检测指标多样化、检测原理复杂化等特点,具体有以下特点:


1、检测速度快、检测项目齐全: 目前广泛使用的全自动凝血分析仪的检测速度多在50-300 次(测试)/小时,最快的可达500次(测试)/小时;检测的项目除常规的凝血筛选实验外,可进行单个凝血、抗凝、纤溶系统因子的检测,也可以进行抗凝及溶栓疗法的监测。


2、活性与抗原性同时检测:目前有的全自动凝血分析仪除了利用血浆凝固法和发色底物法进行有关因子活性检测外, 尚可利用免疫比浊的原理进行这些因子的抗原含量测定。


3、检测通道、同时检测项目多:性能优越的凝血分析仪多有4 个检测通道, 同时检测的项目可以多达l0 个。


4、标本及试剂位多:全自动凝血分析仪一般有超过50个标本位,有的尚设有急诊位可以使紧急标本优先检测。条形码的运用使仪器对标本及所需检测项目进行快速识别。性能优越的凝血分析仪设有多达20 个l5℃ 的试剂位,可以满足多个检测同时进行的需求。由于配备了盖帽贯穿式进样机,有的仪器检测时可以不打开样品管,从而使检测的自动化程度又有提高。


5. 拥有质量控制:某些全自动凝血分析仪拥有10 组各2个质控文件,1个为现用质控文件,另一个是新批号质控文件,以全面支持实验室质控要求。有的全自动凝血分析仪还另外附加了一种新型的多规则质控方法,从而为检验提供具有高可靠性的测试结果。


6. 具有储存、传递结果的功能:计算机技术的应用使仪器可以进行大量检测数据的储存,通过特定的接口可以使检验结果迅速传递到各临床科室。


7. 设有科研通道:目前较高级的凝血分析仪均为用户设计了科研通道,使其应用范围得以扩大。


目前,国内也涌现出一批优秀的凝血分析仪研制和生产企业,如上海太阳生物、北京赛科希德、北京普利生、北京众驰伟业、深圳雷杜等。经过多年的快速发展,国产凝血分析仪产品性能与进口产品差距正在缩小,部分公司提供的凝血分析仪技术水平能够达到国际先进水平,部分性能指标甚至优于国际同类产品。如上海太阳生物开发的UP系列全自动凝血分析仪,集凝固法、发色底物法和免疫比浊法三位一体,采用光学、软件工程、信号与处理、流体力学等技术,能够有效避免光学法检测中高血脂、黄疸和溶血对吸光度或散射光强度的影响,准确度高、重复性好,具有优异分析性能,同时具备友好的用户界面,自动条码扫描和质量控制等功能,检测速度可达500tests/小时。


第四节 发展趋势


凝血分析仪的发展较生化分析仪为短,上世纪70年代凝血因子的活性检测方法问世,80年代发色底物技术的广泛运用使抗凝、纤溶的检测成为可能,近年来,凝血分析仪普遍安装了免疫比浊技术通道及软件,结果使血栓与止血的自动化检测日臻完善;同时由于全自动凝血分析仪检测的快速、简便、结果准确及精密度高等特点,极大地提高了检测的速度及质量。


近年来,凝血分析仪技术得到快速发展,其发展趋势主要表现以下方面:

首先是趋于全自动化方向发展。现在的凝血分析仪已经能够自动化处理一系列动作,不管是标本的前处理,还是分析检测结果,亦或是完成检测之后对标本进行自动拆卸,或者是对仪器进行清理,都实现了自动化。现在,出现了非常先进的能够全自动化工作的凝血分析工作站系统,该系统主要由以下几方面仪器组成:(1)全自动凝血分析仪;(2)离心器;(3)移动式机器人。这种发展趋势能够大大节省检验的人力物力,还能提高效率和准确性。


其次是趋于多功能化方向发展。在现代,很多的凝血分析仪都已经可以通过不同原理的方式同时开展分析,比如说可以在开展检测的时候同时运用如下的方法进行检测:如免疫学、干化学、生物学、超声分析以及物理化学等。


最后是趋于智能化方向发展。自动凝血分析仪不仅能够同时检测各个不同的项目,还可以对这些项目开展任意的组合,这就使得标本的随时插入成为现实,检测也变得更加简便。除此之外,仪器当中还含有质量控制系统,这能够提升检测结果的精确度。

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    第一章血栓与止血诊断的发展历程及趋势


    第一节概述


    血栓与止血诊断是通过对各种因子的检测,从不同方面、不同环节了解其发病原因及病理过程,对血栓性疾病和出血性疾病的病因进行分析。近年来,随着血栓性疾病与出血性疾病在人类疾病谱中地位的变化,以及基础医学,临床医学和实验技术的发展,血栓与止血实验室检测出现了许多新的研究热点和发展趋势,并在全国逐步普及。


    血栓与止血实验室检测的新技术和新方法不断涌现,用于血栓病和出血病的实验诊断项目日新月异,从筛选试验、确诊试验到分子生物学的基因检测、突变基因和异常蛋白的功能研究等,趋向更加简便、特异、系统和全面。


    第二节发展历史


    血栓与止血是一门新兴的边缘交叉学科,涉及基础医学、生物化学、免疫学、分子生物学以及临床医学研究领域。在20世纪上半叶,血液学家主要研究方向为出血及出血性疾病。随着研究的深入,发现血栓形成及其理论似乎较出血及出血性疾病更为重要,因为它在许多非血液疾病,尤其在严重危害人类健康和生命的一些疾病的发展中起重要作用。50年代取得了绝大多数血栓形成机制和血栓性疾病的实验室诊断技术的过程重要研究成果,于同时期提出了著名的内源性和外源性血液凝固通道理论,并将肝素和维生素K拮抗剂用于临床,其它口服抗凝剂也随后应用于静脉血栓和肺动脉血栓的治疗。到70年代,各种临床凝血测试方法的应用使大多数出血性疾病得以诊断和分类,对基础理论和临床实践的研究发展使血栓与止血形成了一门独立的学科,国际血栓与止血学会因此成立,进一步促进了学科的发展。80年代到90年代期间,分子生物学和人类基因组学、蛋白质生物化学、细胞生物学、分子药理学的迅猛发展带动了血栓与止血学科的深入研究与临床应用。许多出血性疾病和血栓性疾病的分子病理机制得到阐明,研制成功不少止血、抗凝和溶栓新药,并出现了许多新的诊断技术,在出血性疾病和血栓性疾病的治疗领域上取得了显著的进步。


    第三节血栓与止血诊断技术发展与应用


    随着血栓与止血的基础理论及其应用研究的日益深入和现代生物医学技术的进步,血栓与止血的检测技术和手段日趋先进和自动化,在临床血栓与止血疾病诊断中更加简便、快速、特异。现将血栓与止血诊断技术的发展现状和临床应用总结如下:


    一、 血栓与止血检测技术

    1、物理学方法

    利用物理学原理构造的特殊仪器对血栓与止血相关的血液成分进行直接或间接检测的方法,通常有三大类:显微镜法、血液流变学法和流式细胞术。目前常用的方法包括手工进行的血清、血浆粘度玻璃管检测法;仪器对全血、血浆、血清黏度测定的锥板法、旋转法,仪器模拟血栓形成的体外血栓测定仪;手工及仪器进行的血小板和红细胞电泳等。流式细胞术则可方便进行血小板糖蛋白及其抗体的检测,以判断血小板功能改变对血栓与止血作用的影响。


    其它还有以光电比浊为原理的血小板聚集仪和利用血小板在玻璃表面具粘附特性的血小板粘附测定仪。


    2、生物学方法

    生物学方法亦称凝固法,即将凝血因子激活剂加入待检血浆中,使血浆发生体外凝固。手工法,可凭肉眼观察到试管中出现纤维蛋白丝或血浆流动停止。凝血分析仪则可连续记录血浆凝固过程中的一系列变化如光、电及机械运动等,并将这些变化信号转变成数据,用计算机收集、处理数据后得出检测结果。这类方法发展最早,使用最广泛。目前,手工检测的凝固法主要有全血法、带部分凝血因子的缓冲液法和血浆法等,后者是现有手工法使用最多的一种检测方法;凝血分析仪使用的凝固法大致可分为三种:电流法、黏度法(亦称磁珠法)和光学法,后者是现有凝血分析仪使用最多的一种检测方法,其包括投射和散射比浊法。


    3、生物化学法

    生物化学方法主要是通过测定产色物质的吸光度变化,以推算待测物的含量。这类方法以酶学方法为基础,可直接定量,所需样品量小,测定结果准确、重复性好,便于标准化和自动化,可对止血与血栓过程中起作用的多种酶原活性进行检测,如凝血酶原、纤溶酶原、蛋白C、蛋白S及抗凝血酶等。手工的生物化学法是指人工配制各种缓冲液和工作液或以各种试剂盒中的试剂直接配成测定液在酶标仪上读出吸光度值,通过标准曲线来计算待测物的含量。凝血分析仪目前使用产色物质检测的指标大致可分为两种模式,即对酶原和酶抑制物进行测定,其特点是快速、稳定和节约试剂。


    4、免疫学方法

    以被检物作为抗原,制备相应的多克隆或单克隆抗体,利用抗原抗体的特异结合反应来对被检物进行定性和定量检测。其包括免疫扩散法、免疫比浊法、免疫电泳法、酶联免疫吸附试验和放射免疫测定等。


    全自动凝血分析仪多采用免疫比浊法,其可通过透射或散射比浊分析来完成。此法的基本原理是当一定波长的光线通过反应混合液时,被其中抗原抗体反应形成的免疫复合物(IC)吸收而减弱。在一定范围内,透射光被吸收的量与IC量呈正相关,而IC的量则与相应抗原和抗体的量呈函数关系。


    手工法应用更广泛,免疫扩散、免疫电泳、酶联免疫吸附试验和放射免疫测定在血浆止血与血栓相关蛋白检测中都使用。


    5、干化学技术

    干化学技术主要用于床旁凝血分析仪,其分析原理是将惰性顺磁铁氧化颗粒(PIOP)均匀分布并结合于可产生凝固或纤溶反应的干试剂中,PIOP可在一固定垂直磁场作用下移动。当血标本通过毛细管作用进入反应层后,可溶解干试剂,并发生相应的凝固和纤溶反应,同时与试剂结合的PIOP在反应过程中通过其移动或摆动幅度的大小改变而提供纤维蛋白形成或溶解的动力学特征,PIOP摆动所产生的光量变化可通过光电检测器记录,然后通过信号放大、转换、计算而得到检测结果。


    6、分子生物学技术  

    利用分子生物学技术对各种出血性、血栓性和血栓前状态疾病进行分子水平的检测和诊断。其中包括用于血友病、血管性血友病、易栓症等单基因病直接诊断的DNA测序、原位分子杂交技术;用于高凝状态、获得性血栓栓塞性疾病等多基因疾病间接诊断的PCR技术。


    二、 血栓与止血检测的临床应用

    1、血栓和止血检测在出血病诊断的应用

    出血病由一期止血缺陷和二期止血缺陷导致,前者主要是指血管壁和血小板缺陷导致的出血,而后者主要是由凝血、抗凝缺陷所导致。


    (1)一期止血缺陷

    参与一期止血的有血管内皮细胞、血小板及纤维蛋白原等,其数量和质量异常均可导致出血。常用的筛选试验是出血时间和血小板计数。出血时间的延长可伴有血小板计数升高、正常或降低,均是出血病的实验室检查表现。血小板计数增多,部分患者患骨髓增殖性肿瘤;血小板计数减少,多见于免疫性血小板减少症(ITP),ITP的诊断目前多是排除性诊断,使用流式微球技术检测血小板上的自身抗体具有敏感性高、特异性强的特点。


    随着技术的进步,作为一期止血的筛选试验,出血时间并未被淘汰,而是方法学上推荐使用模板法检测。国际上普遍使用PFA-100检测血小板功能、抗血小板药物的疗效和血管性血友病。


    (2)二期止血缺陷

    常用的筛选试验是凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)测定,该2 项检测是各级医院开展频率最高的凝血常规检测项目。根据两者同时检测的结果,可以大致对凝血因子缺陷症进行分类,进一步进行单个凝血因子的检测,可以对各类凝血因子缺陷性疾病做出诊断和鉴别诊断。


    (3)纤维蛋白溶解系统异常导致的出血

    纤维蛋白溶解系统组成复杂,作为该系统敏感的筛选试验,联合使用纤维蛋白(原)降解产物和D-二聚体可以完成。


    2、血栓和止血检测在出血病治疗中的作用

    缺乏因子的补充替代治疗往往是出血病尤其是凝血因子缺陷症治疗的主要手段。以往,出血病是手术的禁忌症,随着检测技术和生物医药产业的发展,禁区已经被打破,在输注一定剂量的血液制剂后,及时检测患者体内凝血因子的水平,若达到一定高度,就可以抵御手术出血的风险。围手术期定时检测凝血因子的水平并给予维持,可以保障患者围手术期的止血安全。


    3、血栓和止血检测在血栓病诊断中的作用

    血栓病临床上分为遗传性和获得性。体内主要抗凝蛋白如抗凝血酶、蛋白C、蛋白S的先天性缺乏,可以导致血栓性疾病。对静脉系统血栓病的检测可以发现部分患者具备这种先天性缺陷,但临床上大部分血栓病是各种获得性原因导致的,常用的血栓与止血检测可能无法检测出单一的致栓原因,但可从血管壁、血小板、凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统的检测中发现一个或几个方面的异常。目前,血栓弹力图可检测出患者体内的凝血功能和/或血小板功能抗进。


    4、血栓和止血检测在血栓病治疗中的作用

    肝素和相对分子质量肝素是最常见的肠外抗凝制剂,其作用主要依赖AT质和量的正常。因此,肝素/低相对分子质量肝素抗凝治疗实施以前,必须进行AT活性的检测,若AT活性低于70%,肝素治疗效果降低;AT活性低于50%,则肝素失效,检测中若发现这种情况后,要及时补充含AT制剂,国内的主要是血浆。以往,肝素治疗的监测指标是APTT,但该指标目前认为有较多局限性,因此,直接检测肝素的含量,对临床更有指导价值。目前,可以使用的抗血小板药物的监测手段有血管舒张剂刺激磷蛋白磷化程度、血栓弹力图和血小板聚集试验等。


    5、血栓和止血在优生优育中的应用

    由于先天性出血病和血栓病目前尚无法临床根治,且该类疾病具有遗传给后代的特点,如何通过实验室检测的手段进行优生优育干预,阻止患者的出生,是广大检验医学工作者的任务。以遗传性出血病为例,血友病A和B临床最为常见,且其为染色体伴性隐性遗传,由于男性仅有一条X染色体,一旦被累及即成为患者;女性有两条X染色体,一条被累及则为致病基因的携带者,可遗传给后代。血友病A的基因诊断可以从先证者着手,优先检测占血友病A重型患者的热点突变即FⅧ内含子22倒位和内含子1,若阳性则直接诊断;阴性情况下,可直接进行FⅧ外显子测序。目前,植入前基因诊断已经在国内起步,其整合了辅助生殖技术和基因诊断技术,采取从受精卵中获取个别卵裂球进行检测,将正常卵裂球植入母体子宫的策略,理论上可以彻底阻止单基因遗传疾病的发生,避免反复流产的风险,在遗传性出血病和血栓病的优生优育中有着极其广阔的应用前景。


    第四节国内外血栓与止血诊断相关产品的主要生产企业


    近年来,国家对体外诊断行业发展高度重视,血栓与止血研究得到飞速发展。在血栓与止血诊断行业,涌现出一批具有专业从事血栓与止血诊断产品研发、生产与销售的优秀企业,其产品具有较强竞争力,与进口的跨国公司产品争夺市场,打破进口产品的市场垄断局面,在市场份额中各占半壁江山。在血栓与止血诊断行业,主要企业情况如下:


    一、  国外诊断产品主要生产企业

    1、日本Sysmex 公司

    日本Sysmex 公司是一家主要从事临床检验设备及试剂的开发、制造和销售的跨国企业,创建于1968年,原名为日本东亚医用电子株式会社。公司主要凝血分析系统系列产品包括:CS-2100i/2000i、CA-7000、CA-1500、CA-500系列等全自动和半自动凝血分析仪产品,主要与德国Siemens公司的凝血试剂配套使用,检测项目可包括:PT、APTT、FIB、TT;外源性因子(II,V,VII,X);内源性因子(VIII,IX,XI,XII);AT-III、FDP、D-二聚体、PLG、α2-AP、PC等。


    2、法国STAGO公司

    法国STAGO公司是一家成立于1945年,从药物分析起家,现成为体外诊断(IVD)行业中致力于血栓与止血研究的专业公司。目前血栓与止血诊断相关产品包括:STA-R、STA COMPACT、STA COMPACT CT、Start-4等全自动和半自动凝血分析仪,也同时提供配套的检测试剂,可用于血凝四项、外源性因子、内源性因子等测定。


    3、美国Instrumentation Laboratory公司

    美国IL公司总部设在美国马萨诸塞州,是一家为医院和临床试验室提供创新重症监护、血栓与止血诊断系统以及检测和数据解决方案的领先的生产企业。通过全球战略并购,目前在血栓与止血领域旗下已拥有ACL TOP ® 止血测试系统和HemosIL® 诊断试剂。


    三、 国内诊断产品主要生产企业

    1、上海太阳生物技术有限公司

    上海太阳生物技术有限公司成立于2001年,专业从事血栓与止血诊断领域产品的研发、生产与销售的国家高新技术企业。专注于血栓与止血诊断试剂、全自动凝血分析仪及血凝杯、样品杯等系列产品,提供完整的血栓与止血诊断系统,是国内血栓与止血诊断行业的领军者。主要产品如下:


    (1)体外诊断试剂

    基于凝固法的试剂盒包括:凝血酶原时间(PT)测定试剂盒(冻干型/液体型)、凝血酶时间(TT)测定试剂盒(冻干型/液体型)、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒(冻干型白陶土/液体型白陶土)、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒(鞣花酸)、纤维蛋白原(FIB)含量测定试剂盒(冻干型/液体型)、蛋白S(PS)测定试剂盒、红斑狼疮抗凝物筛选(LAS)测定试剂盒、红斑狼疮抗凝物确诊(LAS)测定试剂盒;


    基于胶乳免疫比浊法的试剂盒包括:D-二聚体(D-Dimer)测定试剂盒、纤维蛋白(原)降解产物(FDP)测定试剂盒;


    基于发色底物法的试剂盒有抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)测定试剂盒、蛋白C(PC)测定试剂盒、肝素测定试剂盒、α2-抗纤溶酶(α2-AP)测定试剂盒;


    基于乳胶凝集法的试剂盒包括:D-二聚体(D-Dimer)测定试剂盒、血浆纤维蛋白(原)降解产物(FDP)测定试剂盒;


    其他包括:凝血质控品、D-二聚体质控品、纤维蛋白(原)降解产物(FDP)质控品、凝血分析用稀释液。


    (2)全自动凝血分析仪

    根据产品的不同测试速度和功能,其UP系列全自动凝血分析仪型号可分为UP1500、UP3000、UP5000、UP5500,集凝固法、发色底物法和免疫比浊法三位一体,由加样系统、恒温系统、测定系统、清洗系统和计算机系统组成,具有自动稀释、自动定标、自动存储、自动查询、自动筛选分析、自动条码扫描等功能。产品性能具有抗干扰能力强、检测灵敏度高、重复性好、软件界面直观友好等特点,最高测定速度达500测试/小时,可广泛应用于临床出血和血栓性疾病诊断,溶栓与抗凝治疗监测及疗效观察等,满足大中小不同规模医院的需求。


    (3)医用耗材

    包括与各种品牌国产和进口血凝仪厂家配套的血凝杯和样品杯,包括日本SYSMEX、美国IL、法国STAGO、德国BE、日本积水、北京普利生、北京赛科希德、深圳雷杜等。


    2、 上海长岛生物技术有限公司

    上海长岛生物技术有限公司主要从事凝血类诊断试剂研发、生产和销售的高科技型企业。2014年3月长岛生物被深圳迈瑞股权投资基金股份有限公司并购。目前,产品主要包括凝固法常规四项:凝血酶原时间(PT)试剂、活化部分凝血活酶(APTT)试剂、凝血酶时间(TT)试剂、纤维蛋白原(FIB)试剂(液体)。


    3、 北京普利生仪器有限公司

    北京普利生仪器有限公司主要从事医疗器械行业高新技术产品研发、生产和销售的现代化企业。主要产品系列包括:全自动和半自动检验类产品:全自动凝血分析仪/半自动血凝仪、全自动血液流变仪、半自动血液流变仪、全自动动态血沉测试仪。体外诊断试剂类产品包括:LBY血液流变仪质控物(含非牛顿和牛顿流体)、PT凝血酶原时间试剂盒、TT 凝血酶时间测定试剂盒、APTT活化部分凝血活酶时间测定试剂盒、FIB纤维蛋白原测定试剂盒。


    4、 北京众驰伟业科技发展有限公司

    北京众驰伟业科技发展有限公司是从事研发、生产、销售医疗检验仪器的高新技术企业。血栓与止血诊断相关产品主要为XL1000系列、XL3200系列、XL3600系列等凝血仪,可用于 APTT、PT、TT、FIB 、D-二聚体、FDP及凝血相关特殊项目,其配套试剂主要为进口试剂,其它还提供血流变仪、自动血沉压积测试仪、特种蛋白仪等。


    5、 北京赛科希德科技发展有限公司

    北京赛科希德科技发展有限公司致力于凝血、血流变、血沉及体外诊断试剂等产品的开发和生产,经过多年发展与沉淀,形成了集仪器、试剂、耗材于一体的产品体系。血栓与止血诊断相关产品主要为SF系列全自动凝血测试仪、SA系列全自动血流变测试仪、SD系列高速动态血沉压积测试仪、SC系列血小板聚集测试仪,并提供配套的试剂和耗材。


    6、 天津美德太平洋科技有限公司

    天津美德太平洋科技有限公司注册在天津市滨海高新区海泰绿色产业基地,是一家专业从事凝血仪器及配套试剂、特定蛋白仪器及配套试剂、葡萄糖/乳酸仪器及专用试剂耗材、细胞生物治疗全产业链产品的专业生产厂家。其血栓与止血相关产品包括RAC系列全自动凝血分析仪以及TS系列半自动血凝仪,可用于PT、APTT、TT和FIB等测定,并可提供配套的凝血试剂以及质控品。

     

    第五节  血栓与止血诊断行业未来展望


    目前,血栓与止血的诊断方法已由一般的筛选试验发展到全新的诊断试验;由手工发检测发展到自动化仪器检测;由观察试验的终点发展到观察试验的功能;由一个试验用一种方法检测发展到可采用多种方法检测;由单个基因突变分析发展到基因总体分析等。随着技术和医学科学的发展,血栓与止血实验检测的新技术和新方法不断涌现,为血栓病和出血病的实验诊断和基础研究提供了高效和准确的科学手段。未来血栓与止血诊断研究的热点和发展趋势大体概括为下:


    1、 基因检测技术

    基因突变是指基因组DNA分子在结构上碱基对的组成或排列顺序发生改变,即可导致个体表型的异常或疾病。目前常用的检测方法是:①点突变分析;②基因连锁分析;③mRNA分析;④DNA序列分析。随着基因治疗技术的不断发展与突破,这些新技术也将可能用于遗传性血栓与止血疾病的基因研究与基因治疗,如CRISPR/Cas9基因编辑技术、Ataluren(PCT124)、靶向药物研究等。


    2、生物芯片技术      

    生物芯片又称微阵列(microarray),是一种新型的基因功能分析技术。它主要是指通过缩微技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统,以实现对基因、蛋白质、细胞以及其他生物组分进行的准确、快速、大信息量的检测。目前生物芯片技术在某些遗传性出血性疾病(如血友病)、血小板疾病、凝血因子分子缺陷性疾病等方面得到广泛的应用。其原理是将一定数量的生物分子有序地固定在固相载体芯片上,加入相应的标记分子与生物分子结合或反应,利用相应的仪器对标志物进行分析。生物芯片在血栓与止血疾病的筛查和早期诊断上具有明显的优势,已经成为检验医学发展的热点之一。


    3、质谱技术

    质谱技术通常是用表面增强激光解析电离时间飞行质谱技术(ELDI-TOF-MS)与蛋白芯片有机结合,对复杂的生物分子混合物进行快速的质谱分析,其检测原理是利用激光脉冲辐射使被结合的蛋白质解析形成质荷电离子,不同质荷比的离子在真空场中飞行的时间长短不一,由此可绘制出质谱。SELDI-TOF-MS可用于直接选择性纯化和定量分析样品中的蛋白质或蛋自肽。若将其与正常人或某种疾病患者的质谱图或u基因库中的质谱作对照或比较,可发现特异性相关蛋白。已有人报道可用于对血栓性血小板减少性紫癜(TTP)进行快速实验诊断,随着SELDI-TOF-MS技术的发展和应用,其将在血栓与止血的实验诊断领域中发挥更大作用。


    4、蛋白质组技术

    二维电泳和质谱技术是蛋白质组学研究的重要手段,其主要用于血小板的基因组蛋白成分的研究。目前血小板蛋白质组技术已成为监测动脉血栓形成及抗血小板药物疗效的新方法。今后,蛋白质组学技术在血栓与止血的检测领域也会有更大的发展。

     

    第二章 凝血分析仪


    第一节 概述


    血栓与止血是一门新兴的边缘学科,涉及基础医学、临床医学及预防医学的各个领域。利用凝血分析仪进行血栓与止血的实验室检查,为出血性和血栓性疾病的诊断与鉴别诊断、溶栓及抗凝治疗的监测与疗效观察提供有价值的指标。随着科学技术的日新月异,血栓与止血检测从传统的手工方法发展到全自动凝血分析仪,从单一的凝固法发展到免疫学和生物化学法,血栓与止血的检测变得简便、准确、精确。


    第二节 发展历史


    1910年Kottman发明了世界上最早的凝血分析仪,通过测定血液凝固时粘度的变化来反应凝固时间。1922年,Kugelmass用浊度计通过测定透射光的变化来反应血浆凝固时间。1950年,Schnitger和Gross发明了基于电流法的凝血分析仪。


    20世纪60年代,机械法凝血分析仪得到开发。70年代以后,由于机械及电子工业的发展,各种类型的全自动凝血分析仪先后问世。80年代,发色底物的问世并应用于血液凝固的检测,使全自动凝血分析仪除可以进行一般的筛选试验外,还可以进行凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统单个因子的检测。80年代末,双磁路磁珠法的发明给血栓与止血的检测带来新概念,由于其独特的设计原理,使光学法检测的一些影响因素在本类型的检测仪器上均不复存在。90年代,全自动凝血分析仪免疫通道的开发又为血栓与止血的检测提供了一种新的手段。到目前为止,国内外凝血分析仪的发展主要经历了初期手工法、电流法、双磁路磁珠法、光学浊度法和光电磁珠法五个阶段。


    光学法及磁珠法的灵敏度高、重复性好、易于自动化,从而使凝血分析仪的应用进入了一个崭新的发展时期。但早期采用光学法检测的凝血分析仪,遇黄疸、乳糜或浑浊等,会对对吸光度或散射光强度产生影响,会造成检测结果不准确。仪器开发制造商对光学法进行了改进,在光散射法的基础上配合了百分比(去本底)凝固时间测定原理,解决了高脂、黄疸和溶血对凝固时间的干扰,并可测出低纤维蛋白原样本的凝固时间。


    第三节 应用现状


    凝血分析仪按自动化程度可分为半自动化及全自动化,前者主要检测一般常规凝血项目,后者则有自动吸样、稀释样品、检测、结果储存、数据传输、结果打印、质量控制等功能,除对凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统功能进行全面的检测,尚能对抗凝、溶栓治疗进行实验室监测。


    目前,国内使用的凝血分析仪主要为进口仪器。早期引进的凝血分析仪多是价格偏低、检测速度慢、测定项目较少的半自动仪器,且数量较少。随着国内经济发展水平的提高,近几年来引进的仪器数量大大增加,主要以全自动的中档仪器为主,主要有日本Sysmex的CA 系列、美国IL的ACL系列、德国的TECO 系列、德国的BE 系列以及法国的STAGO 系列等,这些凝血分析仪都具有自动化程度高、多通道化、检测指标多样化、检测原理复杂化等特点,具体有以下特点:


    1、检测速度快、检测项目齐全: 目前广泛使用的全自动凝血分析仪的检测速度多在50-300 次(测试)/小时,最快的可达500次(测试)/小时;检测的项目除常规的凝血筛选实验外,可进行单个凝血、抗凝、纤溶系统因子的检测,也可以进行抗凝及溶栓疗法的监测。


    2、活性与抗原性同时检测:目前有的全自动凝血分析仪除了利用血浆凝固法和发色底物法进行有关因子活性检测外, 尚可利用免疫比浊的原理进行这些因子的抗原含量测定。


    3、检测通道、同时检测项目多:性能优越的凝血分析仪多有4 个检测通道, 同时检测的项目可以多达l0 个。


    4、标本及试剂位多:全自动凝血分析仪一般有超过50个标本位,有的尚设有急诊位可以使紧急标本优先检测。条形码的运用使仪器对标本及所需检测项目进行快速识别。性能优越的凝血分析仪设有多达20 个l5℃ 的试剂位,可以满足多个检测同时进行的需求。由于配备了盖帽贯穿式进样机,有的仪器检测时可以不打开样品管,从而使检测的自动化程度又有提高。


    5. 拥有质量控制:某些全自动凝血分析仪拥有10 组各2个质控文件,1个为现用质控文件,另一个是新批号质控文件,以全面支持实验室质控要求。有的全自动凝血分析仪还另外附加了一种新型的多规则质控方法,从而为检验提供具有高可靠性的测试结果。


    6. 具有储存、传递结果的功能:计算机技术的应用使仪器可以进行大量检测数据的储存,通过特定的接口可以使检验结果迅速传递到各临床科室。


    7. 设有科研通道:目前较高级的凝血分析仪均为用户设计了科研通道,使其应用范围得以扩大。


    目前,国内也涌现出一批优秀的凝血分析仪研制和生产企业,如上海太阳生物、北京赛科希德、北京普利生、北京众驰伟业、深圳雷杜等。经过多年的快速发展,国产凝血分析仪产品性能与进口产品差距正在缩小,部分公司提供的凝血分析仪技术水平能够达到国际先进水平,部分性能指标甚至优于国际同类产品。如上海太阳生物开发的UP系列全自动凝血分析仪,集凝固法、发色底物法和免疫比浊法三位一体,采用光学、软件工程、信号与处理、流体力学等技术,能够有效避免光学法检测中高血脂、黄疸和溶血对吸光度或散射光强度的影响,准确度高、重复性好,具有优异分析性能,同时具备友好的用户界面,自动条码扫描和质量控制等功能,检测速度可达500tests/小时。


    第四节 发展趋势


    凝血分析仪的发展较生化分析仪为短,上世纪70年代凝血因子的活性检测方法问世,80年代发色底物技术的广泛运用使抗凝、纤溶的检测成为可能,近年来,凝血分析仪普遍安装了免疫比浊技术通道及软件,结果使血栓与止血的自动化检测日臻完善;同时由于全自动凝血分析仪检测的快速、简便、结果准确及精密度高等特点,极大地提高了检测的速度及质量。


    近年来,凝血分析仪技术得到快速发展,其发展趋势主要表现以下方面:

    首先是趋于全自动化方向发展。现在的凝血分析仪已经能够自动化处理一系列动作,不管是标本的前处理,还是分析检测结果,亦或是完成检测之后对标本进行自动拆卸,或者是对仪器进行清理,都实现了自动化。现在,出现了非常先进的能够全自动化工作的凝血分析工作站系统,该系统主要由以下几方面仪器组成:(1)全自动凝血分析仪;(2)离心器;(3)移动式机器人。这种发展趋势能够大大节省检验的人力物力,还能提高效率和准确性。


    其次是趋于多功能化方向发展。在现代,很多的凝血分析仪都已经可以通过不同原理的方式同时开展分析,比如说可以在开展检测的时候同时运用如下的方法进行检测:如免疫学、干化学、生物学、超声分析以及物理化学等。


    最后是趋于智能化方向发展。自动凝血分析仪不仅能够同时检测各个不同的项目,还可以对这些项目开展任意的组合,这就使得标本的随时插入成为现实,检测也变得更加简便。除此之外,仪器当中还含有质量控制系统,这能够提升检测结果的精确度。