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【原创】第三方质控品在临床生化检验中的应用(一)

摘 要

临床实验室,也就是我们常说的检验科是医疗机构中一个非常重要的诊断部门,其检测结果的准确性和可靠性是临床医生对病患进行治疗的重要保障,其检测结果是否稳定也直接影响着临床医生对治疗的判断,因此检验质量的重要性就显的尤为突出,在医疗机构众多的临床诊断部门中临床实验室也是最早进行质量控制的医学部门,对临床实验室进行质量控制也是保证其检验结果准确性和可靠性的有力途径。临床实验室的质量控制不同于工业上的,我们理解的临床实验室的质量控制它其实是一个统计的过程,主要用来监视和评价产生病患标本结果的分析过程。目前临床实验室中使用的质控品从来源来讲主要有两种,一种是仪器试剂厂家配套的质控品,另一种是由第三方生产的质控品,而后者也是国家卫生计生委临床检验中心推荐使用的。但是国内还有很多临床实验室为了省事依旧在用仪器试剂厂家的配套的质控品或者不按要求进行质量控制。临床生化检验目前是检验几大门类中最为成熟的一个门类,按功能分生化检验包括以下几大类:肝功能、肾功能、血脂、糖代谢、心肌、特定蛋白、电解质、胰腺、血凝。本文也将结合临床生化检验的特点探讨下临床实验室使用第三方质控品进行质量控制的重要性,为什么要求并鼓励临床实验室使用第三方质控品?怎样规范的进行质量控制操作,如何正确的解读和分析质控结果?

关键词:第三方质控品,质量控制,统计分析,质控结果


第一章   绪论

临床医学检验的检验数据是临床医生制定治疗方案的主要依据。在我国临床生化诊断是起步最早并且发展最为成熟的一个门类,整体技术水平已达到国际水平。生化诊断试剂基于开放的生化分析仪用于测定体内酶类、脂类、糖类、蛋白和非蛋白、无机元素、肝功能、肾功能等生化指标。目前,国内的生化诊断企业主要是以生产自主品牌的试剂搭配先进的进口生化分析仪的方式进行市场推广,国产自主品牌的生化诊断试剂凭借其高性价比、试剂品种齐全和优质的市场服务等优势,已占据国内生化诊断试剂市场的约80%的市场份额。但是先进的进口仪器和其高性价比以及优质的服务并不能使我们临床检验数据的精确性和准备性得到足够保障。我国的临床实验室的管理水平与发达国家相比,差距甚远。不管是传统的镜检法、手工法还是现在的全自动生化仪器、全自动生化流水线,提高临床实验室的检验数据的精确性、准确性、实验室间的一致性始终是实验室质量管理永恒不变的目标。


临床生化分析仪问世于20世纪50年代,由Skeggs公司首次推出单通道、连续流动式自动分析仪,只能以光密度值形式报告结果,主要用于临床实验室的比色分析。到了20世纪60年代又推出了多通道连续流动式自动生化仪,70年代中期电子计算机控制的自动生化仪问世,到了80年代一直到今天,各个仪器厂家如Roche、Beckman、Olympus、Hitachi、Abbott、Bayer等纷至沓来,使得临床生化分析仪日趋完善。不仅可应用于临床生化的常规检测,同时还能够测定尿液、脑脊液成分、各种药物与毒物、电解质、特定蛋白、激素等,为实验医学提供了广泛的应用空间。纵观临床生化自动分析仪的发展史也是临床生化检测方法学的发展史。


临床生化项目的分析是借助仪器的机械性和电子装置,使生化检验中的主要操作步骤实现机械化和自动化,自动生化分析仪的常用分析方法主要有以下种:

(1) 紫外可见分光光度法:基于被测物质对光的吸收特征和吸收强度对物质进行定性和定量及结构分析的方法

(2) 终点分析法:基于反应达到平衡时反应产物的吸光光谱特征及其对光吸收强度的大小,对被测物质进行定量分析的一类方法。

(3) 连续监测法:测定底物的消耗或产物生成速度的化学方法。

(4) 免疫学测定法:利用可溶性抗原、抗体在液相中的特异性结合,产生一定大小的复合物,形成光的折射或吸收,测定折射或吸收后透射光或散射光作为计算单位。

(5) 干化学分析法:干化学分析法是相对于湿化学分析法而言的,是指将液体检测样品直接加到为不同项目特定生产的商业化的干燥试剂条上,以被测样品的水分作为溶剂引起特定的化学反应,从而进行化学分析的方法。

质量控制的概念由贝尔实验室Walter A.Sheshart首次提出,是基于统计过程控制的基础科学发展而来,目的是为了使生产出来的产品符合产品的质量规格,。1950年Levey-Jennings首次将统计控制引入临床实验室,到了1960年以后临床检验的质量控制发展迅猛,试剂厂家发展出了相似于病人标本的质控品,并将质控品与病人样品一起进入检测系统进行检测,质控品检测得到的结果就是该质控品的控制值。控制值的大小和变化反映了检测系统在检验分析过程中的质量表现。


第二章   临床生化检验


2.1临床生化检验的项目分析法

临床生化检验主要是研究疾病状态下人体内生物化学物质以及其指标变化的一门学科,是临床医学诊断中的一个很重要的分支,属于多学科的一个范畴,生化检验容纳吸收了化学、生物学、数学、病理学、生物化学等学科知识,为评估健康、病人治疗方案的制定、监测防御疾病的发生提供了重要信息。随着医疗技术的发展临床生化检验的分析方法也已经有了长足的进步,各种生物传感器、化学传感器的开发应用,使得项目分析方法从最早传统的分光光度分析法发展到免疫分析法再到干化学分析法变更加复杂多样,下面就生化检验项目的分析方法做概要介绍。


2.1.1紫外可见分光光度法

紫外可见分光光度法(Ultraviolet Visible Spectrophotometry,UV-Vis)是根据物质的分子对紫外可见光区辐射的吸收特性,对物质的组成进行定性或定量及结构分析的方法,属分子吸收。

根据光吸收的基本定律Lambert-Beer定律:

                      A=Kbc                              (2-1)

A为吸光度,K为吸收系数,b为溶液厚度,c为溶液浓度

可知其意义是,当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时,其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。

紫外可见分光光度法具有较高的准确度和灵敏度,仪器设备比较简单,方法可靠快速,在一些需要超高灵敏体系中比如医药卫生、食品检测、生命科学、工农业等领域的得到广泛的应用和关注。

紫外可见分光光度计主要由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示系统组成。


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图2-1 紫外分光光度计简介



2.1.2终点分析法

终点分析法是临床生化检验项目中最常用的分析法,分一点终点法和两点终点法。因为该分析法常有标准液,因此又称比例终点法,是经过一定反应时间后,当反应达到平衡(终点)时做到的一点分析法。

一点终点法是在时间-吸光度曲线上吸光度不在改变时,选择一个时间点测定吸光度的值。通常在反应终点附近连续读两个吸光度,求出两点的平均值,并根据两点的差值判断反应是否达到平衡。

计算公式:

                       C=(Am-Ab)*K                          (2-2)

Am为终点读书点的吸光度,Ab为试剂空白吸光度,K为校正系数


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图2-2 一点终点法反应曲线


两点终点法是指在第二试剂加入以前,选择某一点读取吸光度Am,经过一定时间后反应达终点后测第二个吸光度值An,利用两吸光度之差计算结果。

第一点吸光度值由样本本省或第一试剂与样品的非特异性反应有关,相当于样品空白,可有效的消除样品自身的吸光度,如溶血、脂血、黄疸等的干扰。

计算公式:

                     C=(An-K0*Am)*K                         (2-3)

K0为体积校正因子,K为校正系数


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图2-3 两点终点法的反应曲线



2.1.3连续监测法

连续监测法也叫速率法或动力学法。也就是连续检测反应过程(每15s~1min监测一次),根据测定的产物生成或底物消耗的速度进行定量分析的方法。这种方法的好处是可以将多点的测定结果连成线,很容易找到成直线的区段,来计算酶的活性。

连续监测法分为直接连续监测法和间接连续监测法。


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图2-4 连续监测法的测定时间与吸光度



2.1.4免疫学测定法

这里的免疫学测定法一般指的是免疫比浊分析法。就是抗体与可溶性抗原结合反应形成一定结构的免疫复合物,并成为悬浮于反应溶液中的微粒。在沉淀反应中形成的复合微粒具有特殊的光学性质,可用于仪器检测。

免疫比浊分析又分为透射比浊测定法和散射比浊测定法。带有微小粒子的悬浮液和胶体溶液都具有散射入射光的性质。当一束光线通过此种溶液受到光散和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱。在光源的光路方向测量透射光强度和被检溶液中微粒浓度关系的方法称为散射比浊测定法。

目前免疫比浊分析法会存在抗原过量导致测定结果明显低于实际含量的问题,针对这一问题,检测抗原过量的检测方法有以下4种。

1. 标本用两种稀释度测定。

2. 测定后的反应液中追加被检样品,浊度上升表示有多余抗体,反之,如浊度下降,可能为抗原过量。

3. 测定后的反应液追加抗体,继续观察浊度,浊度上升表示抗原过量。

4. 连续监测抗体抗原反应曲线,抗原过量时曲线异形。

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图2-5 反应体系中抗原抗体浓度变化与抗原抗体复合物关系



2.1.5干化学分析法

干化学(Dry Chemistry)又称干试剂化学,属于固相化学范畴,它指的是将液体样品(血清、血浆、全血、尿液等)直接加到已固化于特殊结构的试剂载体即所谓干式化的试剂中,以样品中的水为溶剂,将固化在载体上的试剂溶解后再与样品中的待测成分进行化学反应,从而进行分析测定的一种方法。

干化学检测项目的试剂也叫干片试剂,从上到下一般分为分布层、辅助层、试剂层和支持层。其中辅助层主要包括:反射层和清除剂层。


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图2-6 干片试剂示意图


将待测样品定量加到干片试剂上,再由分布层把定量样品均匀的展开,并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质等进入试剂层。而样品中的水分子会成为干试剂的溶剂,试剂与带测物质进行化学反应,在辅助层的作用下,产生的化学产物会在显色层与显色试剂一起呈显色反应。而支持层只是一透明的胶片,只是起到支撑干片试剂的作用。整个过程经过一个特定的时间,由反射光度计进行检测分析,光度计的单色光透过支持层、显色层、试剂层,一部分的光线会被吸收,另一部分的光线则会反侧到接收器被检测。待测物的浓度越高,光线被吸收的就会越多,检测到的反射光也越弱,因此,待测物的浓度与吸光度是成正比的关系。


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图2-7 单色光透过试剂干片


干化学目前是即时检验的核心。干试剂片可进行全血的检测、无需定标、干片保存也方便,检测速度快,准确性和重复性好,所以特别适合临床实验室的急诊检验做急诊生化的检测。


2.2生化分析仪

生化分析仪是临床实验室中常用的也是非常重要的诊断仪器之一。它是通过对血液和其他体液的分析来测定各种生化指标,主要分为肝功能、肾功能、心肌疾病、血脂、糖类、特定蛋白、电解质等。并结合临床进行综合分析,可帮助临床医生诊断疾病,为制定治疗方案提供了重要信息。


2.2.1全自动生化分析仪

世界上第一台全自动生化分析仪由美国Technicon公司于1957年推出,标志着医院的临床生化检验正式迈入自动化时代。全自动生化分析仪,从加样至结果的全部过程完全由仪器自动完成,操作者只需将样品放在分析仪的指定的进样位置,设定好程序开动仪器即可等待检验结果出来。

按照反应装置的结构,全自动生化分析仪主要分为流动式、分立式两大类。

1. 流动式:指测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应在同一管道流动的过程中完成。这也是第一代自动生化分析仪。

2. 分立式:各待测样品与试剂混合后的化学反应都是在各自的反应杯中完成、其中有两个分支。

(1) 典型分立式自动生化分析仪。此型号应用最为广。

(2) 离心式自动生化分析仪,每个待测样品都是在离心力的作用下,在各自的反应槽内与试剂混合,完成化学反应并测定。

3. 袋式自动生化分析仪是以试剂袋来代替反应杯和比色杯,每个待测样品在各自的试剂袋内反应并测定结果。

4. 干化学式自动分析仪是将试剂固相于胶片或滤纸片等载体上,每个待测样品滴加在相应试纸条上进行反应测定。

流动式分析仪的整套仪器是由样品盘、比例泵、混合管、透析器、恒温器、比色计和记录器这几个部件组成。


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图2-8 流动式分析仪结构图


流动式分析仪的优点:

1. 自动吸样、自动加试剂能避免人工污染

2. 自动计算浓度值

3. 自动孵育

流动式分析仪的缺点:

1. 只能同时测定一个标本

2. 测试速度慢

3. 需人工清晰孵育盘

现在国内中高档的全自动生化分析仪基本都是分立式分析仪,比如:日立、贝克曼、东芝等,它最大的特点就是速度快、交叉污染小、能同时测定多个项目。它与流动式分析仪最大的区别就在于分立式各个样品和试剂在各自的试管中反应,而流动式是在同一个管道中反应的。


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图2-9 日立7180分立式全自动生化分析仪


离心式分析仪是1969年才发展起来的一种分析仪,它的特点是化学反应器装在离心机的转子位置,也叫转头,先将样品和试剂分别置于转头内,当离心机转动后,圆盘内的样品和试剂受离心力的作用而相互混合发生反应,最后流入圆盘外圈的比色槽内进行比色检测。


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图2-10 离心式分析仪结构



2.2.2半自动生化分析仪

半自动生化分析仪是指在分析过程中的部分操作(如加样、保温、吸入比色、结果记录等某一步骤)需手工完成,而另一部分操作则可由仪器自动完成。这类仪器的特点是体积小,结构简单,灵活性强,可以分开单独使用,也可以与其他仪器配套使用。

半自动生化分析仪的优点是,一是可以直接计算测定项目的含量,免除人工计算.二是可实时监测测定物的吸光度变化,可测定酶法.不足就是需要人工加样,机外孵育标本,测定结果的误差很大。


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图2-11 上海科华半自动生化分析仪


2.2.3干化学分析仪

干式生化分析仪在20世纪80年代由Eastman Kodak公司推出,配套的干式试剂片能测定血清中血糖、尿素、蛋白质、胆固醇等项目。当加上定量的血清后,在干片的前面产生颜色反应,用反射光度计检测就可以进行定量检测。干化学的长足进步也是这近20年的事,源于蛋白质即酶分离、提纯、保存技术的进步,传感器积分球即反射光度计和微电极的发展以及电子计算机的应用。

干式化学的主要特点是:快速、准确、精密。与普通的湿生化分析仪相比显色反应发生的方式和容器是干式生化分析仪与普通湿生化分析仪最主要的不同点,相应的两种生化分析仪的光路系统也有所不同。普通湿式生化分析仪一般是在比色杯中发生显色反应,此外,还采用光电比色法进行分析,其吸光度与被测溶液浓度满足朗伯-比尔定律。干式生化分析仪测完全抛弃了传统的管路系统,使用的是干试剂条作为固相试剂,干试剂条一般是由多层薄膜组成,以美国强生公司的V350干式生化分析仪使用的干试剂条为例,第一层是分布扩散层,能使标本均匀分布,第二层是试剂层,第三层是指示试剂层,包含染料以产生显色复合物。


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 干式生化与湿式生化的测试结果方面,两种方法所有分析项目的R(相关系数)均大于0.93,相关性检验P<0.05.统计结果表明两种仪器的分析结果相关性良好。质量控制与结果校准方面,两种生化分析都可以利用厂家配套的质控品和校准品进行质量控制或校准,但是实际工作中,由于干式生化分析仪的质控品价格较高并且不能反复冻融,所以,一般采用先在湿式生化仪上测定出值后再到干式生化仪上进行质控检查。


2.2.4即时生化检测

即时检测,也称床旁快速检测,英文为:Point of Care Testing(POCT)是体外诊断的一个子行业,指在患者身边进行现场采样检查并分析,快速得到检验结果,省去标本预处理、样本送检、设备检测、数据处理等步骤,使检测、诊断、治疗成为一个连续过程,对于疾病的快速发现和最早治疗具有重要意义,

这种便携式即时生化仪有以下几个优点:

1. 快速、即时、检测时间短、出结果快。

2. 可以在病人床边、身边、患者身边进行检测。

3. 操作简便、携带和使用都很方便。

但是缺陷也很突出,一是检验成本偏高,二是质量控制体系不完善、三是操作者技术水平参差不齐,四是检测项目少。最主要的一点就是检测结果的准确性和仪器的重复性还亟待突破。

微流控技术是近年才发展起来的一门新兴交叉学科。微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的系统所涉及的科学和技术,是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。因为具有微型化、集成化等特征,微流控装置通常被称为微流控芯片,也被称为芯片实验室(Lab on a Chip)和微全分析系统(micro-Total Analytical System)。

针对POCT生化分析仪的应用需求,将微流控技术与生化分析技术相结合发展出了微流控芯片生化分析仪。具备体积小、易操作、多指标、高性能、自动化等特点。其检测原理和湿法的大型全自动生化分析仪相同,都是基于光电比色法和朗伯-比尔定律对物质进行定性定量分析。


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2.3临床生化实验室室内质量控制 

室内质量控制简称室内质控,英文为:Internal Quality Control (IQC),是各个实验室为了检测和评价本实验室的工作质量,以确定检验报告能否发出而做出的一系列检查、控制的手段,包括实验室工作的全部过程,旨在检测和控制本实验室常规工作的精密度,并检测其准确度的改变,提高实验室常规工作中批间和日间标本检测的一致性。狭义的室内质控主要是指从样本采集、预处理、仪器和试剂的校准与定标、操作直到读取检验结果等整个分析过程和测量系统的质量控制,从广义上来讲,质量控制主要涉及分析前、分析中、分析后这三个阶段的控制。

1. 分析前阶段:病人准备、标本采集、标本保存和运输。

2. 分析中阶段:建立项目操作程序、试剂、质控物的质量要稳定、仪器校准调试。

3. 分析后阶段:检测报告正确发出、临床咨询服务、室内质控资料管理、参加室间质评。


室内质控和室间质评是临床实验室实施实验室质量保证的重要组成部分。室间质评,英文为:External Quality Assessment(EQA)是指多家实验室分析同一标本,由外部独立机构分析和反馈实验室的检测结果,用于评定实验室常规工作的质量,观察实验的准确性,建立各实验室之间的可比性。

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随着近几年医疗技术的不断发展和进步,自动化的分析仪器在临床广发应用,生化检验结果的准确性和重复性也有了明显的提高,但是在做质量控制的时候还是有很多不足之处亟需改进。

未完待续...


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    【原创】第三方质控品在临床生化检验中的应用(一)

    摘 要

    临床实验室,也就是我们常说的检验科是医疗机构中一个非常重要的诊断部门,其检测结果的准确性和可靠性是临床医生对病患进行治疗的重要保障,其检测结果是否稳定也直接影响着临床医生对治疗的判断,因此检验质量的重要性就显的尤为突出,在医疗机构众多的临床诊断部门中临床实验室也是最早进行质量控制的医学部门,对临床实验室进行质量控制也是保证其检验结果准确性和可靠性的有力途径。临床实验室的质量控制不同于工业上的,我们理解的临床实验室的质量控制它其实是一个统计的过程,主要用来监视和评价产生病患标本结果的分析过程。目前临床实验室中使用的质控品从来源来讲主要有两种,一种是仪器试剂厂家配套的质控品,另一种是由第三方生产的质控品,而后者也是国家卫生计生委临床检验中心推荐使用的。但是国内还有很多临床实验室为了省事依旧在用仪器试剂厂家的配套的质控品或者不按要求进行质量控制。临床生化检验目前是检验几大门类中最为成熟的一个门类,按功能分生化检验包括以下几大类:肝功能、肾功能、血脂、糖代谢、心肌、特定蛋白、电解质、胰腺、血凝。本文也将结合临床生化检验的特点探讨下临床实验室使用第三方质控品进行质量控制的重要性,为什么要求并鼓励临床实验室使用第三方质控品?怎样规范的进行质量控制操作,如何正确的解读和分析质控结果?

    关键词:第三方质控品,质量控制,统计分析,质控结果


    第一章   绪论

    临床医学检验的检验数据是临床医生制定治疗方案的主要依据。在我国临床生化诊断是起步最早并且发展最为成熟的一个门类,整体技术水平已达到国际水平。生化诊断试剂基于开放的生化分析仪用于测定体内酶类、脂类、糖类、蛋白和非蛋白、无机元素、肝功能、肾功能等生化指标。目前,国内的生化诊断企业主要是以生产自主品牌的试剂搭配先进的进口生化分析仪的方式进行市场推广,国产自主品牌的生化诊断试剂凭借其高性价比、试剂品种齐全和优质的市场服务等优势,已占据国内生化诊断试剂市场的约80%的市场份额。但是先进的进口仪器和其高性价比以及优质的服务并不能使我们临床检验数据的精确性和准备性得到足够保障。我国的临床实验室的管理水平与发达国家相比,差距甚远。不管是传统的镜检法、手工法还是现在的全自动生化仪器、全自动生化流水线,提高临床实验室的检验数据的精确性、准确性、实验室间的一致性始终是实验室质量管理永恒不变的目标。


    临床生化分析仪问世于20世纪50年代,由Skeggs公司首次推出单通道、连续流动式自动分析仪,只能以光密度值形式报告结果,主要用于临床实验室的比色分析。到了20世纪60年代又推出了多通道连续流动式自动生化仪,70年代中期电子计算机控制的自动生化仪问世,到了80年代一直到今天,各个仪器厂家如Roche、Beckman、Olympus、Hitachi、Abbott、Bayer等纷至沓来,使得临床生化分析仪日趋完善。不仅可应用于临床生化的常规检测,同时还能够测定尿液、脑脊液成分、各种药物与毒物、电解质、特定蛋白、激素等,为实验医学提供了广泛的应用空间。纵观临床生化自动分析仪的发展史也是临床生化检测方法学的发展史。


    临床生化项目的分析是借助仪器的机械性和电子装置,使生化检验中的主要操作步骤实现机械化和自动化,自动生化分析仪的常用分析方法主要有以下种:

    (1) 紫外可见分光光度法:基于被测物质对光的吸收特征和吸收强度对物质进行定性和定量及结构分析的方法

    (2) 终点分析法:基于反应达到平衡时反应产物的吸光光谱特征及其对光吸收强度的大小,对被测物质进行定量分析的一类方法。

    (3) 连续监测法:测定底物的消耗或产物生成速度的化学方法。

    (4) 免疫学测定法:利用可溶性抗原、抗体在液相中的特异性结合,产生一定大小的复合物,形成光的折射或吸收,测定折射或吸收后透射光或散射光作为计算单位。

    (5) 干化学分析法:干化学分析法是相对于湿化学分析法而言的,是指将液体检测样品直接加到为不同项目特定生产的商业化的干燥试剂条上,以被测样品的水分作为溶剂引起特定的化学反应,从而进行化学分析的方法。

    质量控制的概念由贝尔实验室Walter A.Sheshart首次提出,是基于统计过程控制的基础科学发展而来,目的是为了使生产出来的产品符合产品的质量规格,。1950年Levey-Jennings首次将统计控制引入临床实验室,到了1960年以后临床检验的质量控制发展迅猛,试剂厂家发展出了相似于病人标本的质控品,并将质控品与病人样品一起进入检测系统进行检测,质控品检测得到的结果就是该质控品的控制值。控制值的大小和变化反映了检测系统在检验分析过程中的质量表现。


    第二章   临床生化检验


    2.1临床生化检验的项目分析法

    临床生化检验主要是研究疾病状态下人体内生物化学物质以及其指标变化的一门学科,是临床医学诊断中的一个很重要的分支,属于多学科的一个范畴,生化检验容纳吸收了化学、生物学、数学、病理学、生物化学等学科知识,为评估健康、病人治疗方案的制定、监测防御疾病的发生提供了重要信息。随着医疗技术的发展临床生化检验的分析方法也已经有了长足的进步,各种生物传感器、化学传感器的开发应用,使得项目分析方法从最早传统的分光光度分析法发展到免疫分析法再到干化学分析法变更加复杂多样,下面就生化检验项目的分析方法做概要介绍。


    2.1.1紫外可见分光光度法

    紫外可见分光光度法(Ultraviolet Visible Spectrophotometry,UV-Vis)是根据物质的分子对紫外可见光区辐射的吸收特性,对物质的组成进行定性或定量及结构分析的方法,属分子吸收。

    根据光吸收的基本定律Lambert-Beer定律:

                          A=Kbc                              (2-1)

    A为吸光度,K为吸收系数,b为溶液厚度,c为溶液浓度

    可知其意义是,当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时,其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。

    紫外可见分光光度法具有较高的准确度和灵敏度,仪器设备比较简单,方法可靠快速,在一些需要超高灵敏体系中比如医药卫生、食品检测、生命科学、工农业等领域的得到广泛的应用和关注。

    紫外可见分光光度计主要由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示系统组成。


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    图2-1 紫外分光光度计简介



    2.1.2终点分析法

    终点分析法是临床生化检验项目中最常用的分析法,分一点终点法和两点终点法。因为该分析法常有标准液,因此又称比例终点法,是经过一定反应时间后,当反应达到平衡(终点)时做到的一点分析法。

    一点终点法是在时间-吸光度曲线上吸光度不在改变时,选择一个时间点测定吸光度的值。通常在反应终点附近连续读两个吸光度,求出两点的平均值,并根据两点的差值判断反应是否达到平衡。

    计算公式:

                           C=(Am-Ab)*K                          (2-2)

    Am为终点读书点的吸光度,Ab为试剂空白吸光度,K为校正系数


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    图2-2 一点终点法反应曲线


    两点终点法是指在第二试剂加入以前,选择某一点读取吸光度Am,经过一定时间后反应达终点后测第二个吸光度值An,利用两吸光度之差计算结果。

    第一点吸光度值由样本本省或第一试剂与样品的非特异性反应有关,相当于样品空白,可有效的消除样品自身的吸光度,如溶血、脂血、黄疸等的干扰。

    计算公式:

                         C=(An-K0*Am)*K                         (2-3)

    K0为体积校正因子,K为校正系数


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    图2-3 两点终点法的反应曲线



    2.1.3连续监测法

    连续监测法也叫速率法或动力学法。也就是连续检测反应过程(每15s~1min监测一次),根据测定的产物生成或底物消耗的速度进行定量分析的方法。这种方法的好处是可以将多点的测定结果连成线,很容易找到成直线的区段,来计算酶的活性。

    连续监测法分为直接连续监测法和间接连续监测法。


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    图2-4 连续监测法的测定时间与吸光度



    2.1.4免疫学测定法

    这里的免疫学测定法一般指的是免疫比浊分析法。就是抗体与可溶性抗原结合反应形成一定结构的免疫复合物,并成为悬浮于反应溶液中的微粒。在沉淀反应中形成的复合微粒具有特殊的光学性质,可用于仪器检测。

    免疫比浊分析又分为透射比浊测定法和散射比浊测定法。带有微小粒子的悬浮液和胶体溶液都具有散射入射光的性质。当一束光线通过此种溶液受到光散和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱。在光源的光路方向测量透射光强度和被检溶液中微粒浓度关系的方法称为散射比浊测定法。

    目前免疫比浊分析法会存在抗原过量导致测定结果明显低于实际含量的问题,针对这一问题,检测抗原过量的检测方法有以下4种。

    1. 标本用两种稀释度测定。

    2. 测定后的反应液中追加被检样品,浊度上升表示有多余抗体,反之,如浊度下降,可能为抗原过量。

    3. 测定后的反应液追加抗体,继续观察浊度,浊度上升表示抗原过量。

    4. 连续监测抗体抗原反应曲线,抗原过量时曲线异形。

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    图2-5 反应体系中抗原抗体浓度变化与抗原抗体复合物关系



    2.1.5干化学分析法

    干化学(Dry Chemistry)又称干试剂化学,属于固相化学范畴,它指的是将液体样品(血清、血浆、全血、尿液等)直接加到已固化于特殊结构的试剂载体即所谓干式化的试剂中,以样品中的水为溶剂,将固化在载体上的试剂溶解后再与样品中的待测成分进行化学反应,从而进行分析测定的一种方法。

    干化学检测项目的试剂也叫干片试剂,从上到下一般分为分布层、辅助层、试剂层和支持层。其中辅助层主要包括:反射层和清除剂层。


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    图2-6 干片试剂示意图


    将待测样品定量加到干片试剂上,再由分布层把定量样品均匀的展开,并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质等进入试剂层。而样品中的水分子会成为干试剂的溶剂,试剂与带测物质进行化学反应,在辅助层的作用下,产生的化学产物会在显色层与显色试剂一起呈显色反应。而支持层只是一透明的胶片,只是起到支撑干片试剂的作用。整个过程经过一个特定的时间,由反射光度计进行检测分析,光度计的单色光透过支持层、显色层、试剂层,一部分的光线会被吸收,另一部分的光线则会反侧到接收器被检测。待测物的浓度越高,光线被吸收的就会越多,检测到的反射光也越弱,因此,待测物的浓度与吸光度是成正比的关系。


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    图2-7 单色光透过试剂干片


    干化学目前是即时检验的核心。干试剂片可进行全血的检测、无需定标、干片保存也方便,检测速度快,准确性和重复性好,所以特别适合临床实验室的急诊检验做急诊生化的检测。


    2.2生化分析仪

    生化分析仪是临床实验室中常用的也是非常重要的诊断仪器之一。它是通过对血液和其他体液的分析来测定各种生化指标,主要分为肝功能、肾功能、心肌疾病、血脂、糖类、特定蛋白、电解质等。并结合临床进行综合分析,可帮助临床医生诊断疾病,为制定治疗方案提供了重要信息。


    2.2.1全自动生化分析仪

    世界上第一台全自动生化分析仪由美国Technicon公司于1957年推出,标志着医院的临床生化检验正式迈入自动化时代。全自动生化分析仪,从加样至结果的全部过程完全由仪器自动完成,操作者只需将样品放在分析仪的指定的进样位置,设定好程序开动仪器即可等待检验结果出来。

    按照反应装置的结构,全自动生化分析仪主要分为流动式、分立式两大类。

    1. 流动式:指测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应在同一管道流动的过程中完成。这也是第一代自动生化分析仪。

    2. 分立式:各待测样品与试剂混合后的化学反应都是在各自的反应杯中完成、其中有两个分支。

    (1) 典型分立式自动生化分析仪。此型号应用最为广。

    (2) 离心式自动生化分析仪,每个待测样品都是在离心力的作用下,在各自的反应槽内与试剂混合,完成化学反应并测定。

    3. 袋式自动生化分析仪是以试剂袋来代替反应杯和比色杯,每个待测样品在各自的试剂袋内反应并测定结果。

    4. 干化学式自动分析仪是将试剂固相于胶片或滤纸片等载体上,每个待测样品滴加在相应试纸条上进行反应测定。

    流动式分析仪的整套仪器是由样品盘、比例泵、混合管、透析器、恒温器、比色计和记录器这几个部件组成。


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    图2-8 流动式分析仪结构图


    流动式分析仪的优点:

    1. 自动吸样、自动加试剂能避免人工污染

    2. 自动计算浓度值

    3. 自动孵育

    流动式分析仪的缺点:

    1. 只能同时测定一个标本

    2. 测试速度慢

    3. 需人工清晰孵育盘

    现在国内中高档的全自动生化分析仪基本都是分立式分析仪,比如:日立、贝克曼、东芝等,它最大的特点就是速度快、交叉污染小、能同时测定多个项目。它与流动式分析仪最大的区别就在于分立式各个样品和试剂在各自的试管中反应,而流动式是在同一个管道中反应的。


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    图2-9 日立7180分立式全自动生化分析仪


    离心式分析仪是1969年才发展起来的一种分析仪,它的特点是化学反应器装在离心机的转子位置,也叫转头,先将样品和试剂分别置于转头内,当离心机转动后,圆盘内的样品和试剂受离心力的作用而相互混合发生反应,最后流入圆盘外圈的比色槽内进行比色检测。


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    图2-10 离心式分析仪结构



    2.2.2半自动生化分析仪

    半自动生化分析仪是指在分析过程中的部分操作(如加样、保温、吸入比色、结果记录等某一步骤)需手工完成,而另一部分操作则可由仪器自动完成。这类仪器的特点是体积小,结构简单,灵活性强,可以分开单独使用,也可以与其他仪器配套使用。

    半自动生化分析仪的优点是,一是可以直接计算测定项目的含量,免除人工计算.二是可实时监测测定物的吸光度变化,可测定酶法.不足就是需要人工加样,机外孵育标本,测定结果的误差很大。


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    图2-11 上海科华半自动生化分析仪


    2.2.3干化学分析仪

    干式生化分析仪在20世纪80年代由Eastman Kodak公司推出,配套的干式试剂片能测定血清中血糖、尿素、蛋白质、胆固醇等项目。当加上定量的血清后,在干片的前面产生颜色反应,用反射光度计检测就可以进行定量检测。干化学的长足进步也是这近20年的事,源于蛋白质即酶分离、提纯、保存技术的进步,传感器积分球即反射光度计和微电极的发展以及电子计算机的应用。

    干式化学的主要特点是:快速、准确、精密。与普通的湿生化分析仪相比显色反应发生的方式和容器是干式生化分析仪与普通湿生化分析仪最主要的不同点,相应的两种生化分析仪的光路系统也有所不同。普通湿式生化分析仪一般是在比色杯中发生显色反应,此外,还采用光电比色法进行分析,其吸光度与被测溶液浓度满足朗伯-比尔定律。干式生化分析仪测完全抛弃了传统的管路系统,使用的是干试剂条作为固相试剂,干试剂条一般是由多层薄膜组成,以美国强生公司的V350干式生化分析仪使用的干试剂条为例,第一层是分布扩散层,能使标本均匀分布,第二层是试剂层,第三层是指示试剂层,包含染料以产生显色复合物。


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     干式生化与湿式生化的测试结果方面,两种方法所有分析项目的R(相关系数)均大于0.93,相关性检验P<0.05.统计结果表明两种仪器的分析结果相关性良好。质量控制与结果校准方面,两种生化分析都可以利用厂家配套的质控品和校准品进行质量控制或校准,但是实际工作中,由于干式生化分析仪的质控品价格较高并且不能反复冻融,所以,一般采用先在湿式生化仪上测定出值后再到干式生化仪上进行质控检查。


    2.2.4即时生化检测

    即时检测,也称床旁快速检测,英文为:Point of Care Testing(POCT)是体外诊断的一个子行业,指在患者身边进行现场采样检查并分析,快速得到检验结果,省去标本预处理、样本送检、设备检测、数据处理等步骤,使检测、诊断、治疗成为一个连续过程,对于疾病的快速发现和最早治疗具有重要意义,

    这种便携式即时生化仪有以下几个优点:

    1. 快速、即时、检测时间短、出结果快。

    2. 可以在病人床边、身边、患者身边进行检测。

    3. 操作简便、携带和使用都很方便。

    但是缺陷也很突出,一是检验成本偏高,二是质量控制体系不完善、三是操作者技术水平参差不齐,四是检测项目少。最主要的一点就是检测结果的准确性和仪器的重复性还亟待突破。

    微流控技术是近年才发展起来的一门新兴交叉学科。微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的系统所涉及的科学和技术,是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。因为具有微型化、集成化等特征,微流控装置通常被称为微流控芯片,也被称为芯片实验室(Lab on a Chip)和微全分析系统(micro-Total Analytical System)。

    针对POCT生化分析仪的应用需求,将微流控技术与生化分析技术相结合发展出了微流控芯片生化分析仪。具备体积小、易操作、多指标、高性能、自动化等特点。其检测原理和湿法的大型全自动生化分析仪相同,都是基于光电比色法和朗伯-比尔定律对物质进行定性定量分析。


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    2.3临床生化实验室室内质量控制 

    室内质量控制简称室内质控,英文为:Internal Quality Control (IQC),是各个实验室为了检测和评价本实验室的工作质量,以确定检验报告能否发出而做出的一系列检查、控制的手段,包括实验室工作的全部过程,旨在检测和控制本实验室常规工作的精密度,并检测其准确度的改变,提高实验室常规工作中批间和日间标本检测的一致性。狭义的室内质控主要是指从样本采集、预处理、仪器和试剂的校准与定标、操作直到读取检验结果等整个分析过程和测量系统的质量控制,从广义上来讲,质量控制主要涉及分析前、分析中、分析后这三个阶段的控制。

    1. 分析前阶段:病人准备、标本采集、标本保存和运输。

    2. 分析中阶段:建立项目操作程序、试剂、质控物的质量要稳定、仪器校准调试。

    3. 分析后阶段:检测报告正确发出、临床咨询服务、室内质控资料管理、参加室间质评。


    室内质控和室间质评是临床实验室实施实验室质量保证的重要组成部分。室间质评,英文为:External Quality Assessment(EQA)是指多家实验室分析同一标本,由外部独立机构分析和反馈实验室的检测结果,用于评定实验室常规工作的质量,观察实验的准确性,建立各实验室之间的可比性。

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    随着近几年医疗技术的不断发展和进步,自动化的分析仪器在临床广发应用,生化检验结果的准确性和重复性也有了明显的提高,但是在做质量控制的时候还是有很多不足之处亟需改进。

    未完待续...